基于網絡藥理學探討補肺活血膠囊干預肺結節的作用機制*

吳戈平，胡薏敏，謝 緯，2，劉 玉，2，陳 生，2△

1 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518000； 2 深圳市中醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東 深圳 518000

近年來，臨床上肺結節的檢出率不斷提高。《肺結節診治中國專家共識（2018 年版）》將肺結節定義為直徑≤3 cm 的孤立性或多發性的局灶性、類圓形腫塊，其中孤立性結節多被肺實質包裹，不伴肺不張、肺門增大或胸腔積液［1］。中醫典籍無“肺結節”“肺癌”的病名記載，有研究者認為本病應從“肺積”［2］論治，亦有從“痰”［3］“窠囊”［4］“絡病”［5］論治本病者。陳生教授認為，肺結節應屬“肺積”范疇，病因目前仍未完全明了，大致認為與外感因素、環境因素、職業因素、情志因素、飲食偏頗、宿有舊疾等相關。其病機是正氣虧損，陰陽失調，六淫之邪乘虛入肺，或他臟病變，日久犯肺，邪滯于肺，導致肺臟功能失調，肺氣阻郁，宣降失司，氣機不利，血行受阻，津液失于輸布，津聚為痰，痰凝氣滯，瘀阻脈絡，于是痰濕瘀毒膠結，日久形成肺部結節。

補肺活血膠囊（簡稱BFHX）由黃芪、赤芍、補骨脂組成，具有益氣活血、補肺固腎的功效，臨床可用于治療肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、重癥肺炎等疾病［6-7］。臨床治療方面，手術切除是治療惡性結節的首選方案，對于中低危結節仍以抗炎治療和隨訪為主，缺乏有效的干預措施。然而HU等［8］通過多區域外顯子組測序技術證實腫瘤演變是動態過程，可能隨著時間進展而變化，這一發現充分說明肺結節全過程干預的有效性和必要性。中醫中藥可補充西醫的不足之處，抑制肺結節倍增時間、降低轉癌風險，緩解患者的焦慮，且經濟便捷，應用前景廣闊。本文擬通過網絡藥理學聯合分子對接技術探討BFHX 干預肺結節的作用機制，網絡藥理學有利于揭示中藥復方多成分、多靶點的治療或干預作用。

1 資料與方法

1.1 數據庫本研究所需數據庫及網址見表1。

表1 數據庫及網址

1.2 BFHX活性成分及對應靶點篩選通過TCMSP及BATMAN-TCM 數據庫，檢索BFHX 組成“黃芪”“赤芍”“補骨脂”的化學成分，TCMSP 按照口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18 設置參數，BATMAN-TCM中按照分數截至值≥20 且校正后，P值=0.05，設置參數篩選潛在的具有較高活性成分的化合物。

1.3 肺結節靶點獲取在GeneCards、OMIM、CTD數據庫中以“Pulmonary nodule”作為關鍵詞對肺結節相關靶點進行檢索，對評分高的靶點進行篩查，獲得肺結節已知的可靠靶點，并篩選其中屬人種的靶點，利用R 4.1.2語言將BFHX與肺結節的靶點取交集，繪制韋恩圖，得到BFHX 干預肺結節的預測靶點。

1.4 BFHX 干預肺結節的網絡構建及分析利用STRING 11.5 在線數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction networks，PPI），設置可信度＞0.99，將所獲得的TSV文件導入Cytoscape 3.7.1 軟件中，通過CytoNCA插件，以Degree 值為篩選條件，選擇大于中位數的數據，進一步篩選BFHX 干預肺結節的核心靶點，構建藥物成分-核心靶點-疾病網絡。

1.5 核心靶點基因功能富集和通路富集分析通過R 4.1.2 語言的Bioconductor 軟件包對BFHX干預肺結節的核心靶點進行GO 與KEGG 分析，GO生物分析通過生物途徑（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）進行說明與注釋。

1.6 藥物成分-核心靶點分子對接驗證利用分子對接模擬軟件Autodock Vina 1.1.2 對黃芪-赤芍-補骨脂主要活性成分與肺結節核心靶點進行分子對接。通過PubChem 數據庫獲取黃芪-赤芍-補骨脂主要活性成分的2D結構，并利用Chem-Office 軟件進行3D 結構轉換。通過UniProt 蛋白數據庫查找肺結節核心靶點的蛋白ID，并在PDB 數據庫下載核心靶點蛋白的3D 結構，以PDB格式保存。利用Pymol 軟件去除水分子及小分子配體。用AutoDockTools 1.5.7 軟件對蛋白受體加氫，并將受體和配體的文件轉換為PDBQT 格式。用vina 進行分子對接，找到蛋白受體和小分子配體和結合位點并計算該位點下的結合能（自由能）。結合能越低，配體與受體結合構象越穩定，分子與靶點蛋白作用越突出。

2 結果

2.1 BFHX 中活性成分與對應靶點在TCMSP 數據庫（截至2021年11月）和BATMAN-TCM數據庫（截至2021年11月）中篩選得到BFHX有效成分52個。

2.2 潛在作用靶點篩選結果各數據庫收集的疾病靶點個數。詳見表2。與Uniprot 數據庫核對后，刪去未經驗證的，最終獲得肺結節相關靶點7499 個。將疾病靶點與藥物靶點經Venn 圖取交集后共獲得潛在靶點230個，見圖1。構建“方藥-成分-靶點”網絡見圖2。拓撲分析表明，BFHX中等鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、β-谷甾醇、谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇、兒茶素、7-O-甲基異丙胺醇等成分作用的靶點最多，是BFHX干預肺結節的主要成分。

表2 各數據庫收集的疾病靶點

圖1 BFHX與肺結節交集靶點韋恩圖

圖2 方藥-成分-靶點

2.3 PPl 網絡構建結果將“2.2”項下的潛在作用靶點輸入STRING 數據庫，以置信度（combined score＞0.95）為標準，構建PPI 網絡，見圖3A，該網絡包含156 個靶點和822 條對應關系，平均度（Degree）值10.53，最大值為68。靶點的度值越大，與其相連的靶點越多，在網絡關系中越重要。應用CytoNCA 插件，相關參數均為默認，識別到PPI 網絡的2 個子模塊見圖3B，并得出前10 個關鍵靶點。見表3，圖3。

表3 BFHX干預肺結節的關鍵靶點

圖3 A PPI網絡

圖3 B 核心靶點篩選

2.4 GO富集分析結果從DAVID數據庫得到GO富集分析（P＜0.05）條目共2645 個，其中生物過程2305個，分子功能252個，細胞組分88個，對Q值排序后取前10名進行分析見圖4。BFHX干預肺結節的潛在靶點主要參與CC 的有鉀離子通道蛋白復合體、膜筏、膜微區等；參與MF 的包括配體-活化轉錄因子活性、電壓-門控鉀通道活性、脫氧核糖核酸-結合轉錄因子等；參與的主要BP 包括對脂多糖的反應、對金屬離子的反應、對細菌源性分子的反應等，表明BFHX可以通過多種途徑干預肺結節。

圖4 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析結果用R軟件對共同靶點進行KEGG 信號通路富集，得到KEGG 通路（P＜0.05）168 條，閾值設置Q＜0.05，排序后取前30 名進行分析，見圖5。KEGG富集最顯著的15條通路分別是主要包括脂質相關通路、癌癥相關通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、化學致癌-受體激活、炎癥及感染性疾病相關通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路等。結果顯示，BFHX可能通過抗病毒、抗腫瘤、調節內分泌水平、抑制炎性反應、神經通路調節、蛋白質通路調節等方式干預肺結節。

圖5 KEGG富集分析

2.6 藥物成分-核心靶點分子對接分析選取BFHX 有效活性成分度值前5 的關鍵藥效物質與BFHX 干預肺結節最關鍵的3 個靶點蛋白AKT1、JUN、TP53進行分子對接驗證。對接結果如表4所示，結合性最強的化合物-靶點相關的蛋白和化合物三維結構對接圖見圖6—8。BFHX中的關鍵活性成分與核心靶點結合能均值為-8.03 kcal/mol，提示這些活性成分與核心靶點蛋白的結合性較強，其中槲皮素與靶點對接活性最好。

圖6 核心靶點蛋白AKT1與化合物三維結構對接圖

表4 BFHX活性成分-核心靶點分子對接

圖7 核心靶點蛋白JUN與化合物三維結構對接圖

圖8 核心靶點蛋白TP53與化合物三維結構對接圖

3 討論

3.1 肺結節與肺癌間的關系有研究認為，磨玻璃結節樣肺癌不同于以往對早期肺癌的認識，是1 種特殊亞型［9］，相關針對49 例患者磨玻璃結節的組織病理學研究顯示，肺結節肺腺癌的組織學譜有很強的相關性［10-11］，磨玻璃影的肺惡性結節受持續的激活突變影響，通過免疫逃逸并激活微環境以促進血管生成、侵襲、上皮-間充質改變，最終進展為晚期轉移性腫瘤［12］。然而肺結節的術前診斷高度依賴影像學，并且部分實性結節的磨玻璃成分和實性成分在影像學表現與病理學測量上并無特異性［13］，因此對存在判斷風險的肺結節進行手術切除，會使患者經受非必要的手術及并發癥影響［14］。多組學分析表征顯示表現為磨玻璃影的惡性肺結節具有較低的突變負擔、較低的活性免疫環境和較少的ctDNA脫落，這可能是其惰性臨床病程的機制［15］。低級別亞型結節與早期肺腺癌間的異質性研究可能會揭示這些結節中抗腫瘤免疫和免疫逃逸之間的生物張力，并推動部分腫瘤的后續進展、侵襲和轉移［12，16］。

3.2 BFHX 成分分析BFHX 膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂組成。方中黃芪具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調節、改善化療藥物耐藥等作用［17-18］；赤芍對肺動脈高壓、心血管系統疾病有良好的治療效果［19］，可有效抑制癌細胞增殖［20］、誘導腫瘤細胞凋亡［21］、抑制腫瘤細胞遷移和侵襲［22］；補骨脂中的多種化合物具有抗腫瘤、抗癌細胞增殖、抗炎、抗氧化［23-26］的作用。本研究借助數據庫獲得BFHX 活性成分52個，成分-靶點網絡顯示的關鍵化合物包括7-O-甲基異丙胺醇、異補骨脂素、刺芒丙花素、山柰酚、槲皮素等。槲皮素是一種具有抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用的黃酮醇類化合物［27］。WANG 等［28］研究表明，槲皮素通過調節miR-16-5p 和WEE1 表達來增強非小細胞肺癌細胞的放射敏感性。在肺腺癌中槲皮素能夠抑制PI3K/Akt 信號通路的激活，增強癌細胞對順鉑的耐藥性，促進腫瘤細胞的凋亡［29］。異補骨脂素是一種呋喃香豆素類化合物，是中藥補骨脂的重要活性成分之一［30］，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用［31-32］，可抑制LncRNA THOR 的表達［33］。LncRNA THOR 是一種內源性RNA分子，可以調節腫瘤細胞的生長。在非小細胞肺癌細胞中，Lnc-THOR 通過與IGF2BP1 結合加速非小細胞肺癌細胞的增殖，表明Lnc-THOR 可能是治療非小細胞肺癌的一種新型靶點［34］。山柰酚是一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗菌等多種功效［35-36］，它可通過抑制miR21的表達抑制非小細胞肺癌A549 細胞的增殖［37］。miR-21 是一種多效性miRNA，miR-21的過表達可以誘導AKT 的活化從而影響病理性肺重塑［38］，miR-21 的敲除也可抑制細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成［39］。刺芒柄花素是中藥黃芪中分離出的一種具有生物活性的化合物，具有免疫調節、抗氧化、抗炎、抗癌等作用［40］，刺芒柄花素可以通過抑制NSCLC 中的EGFR-Akt-Mcl-1軸來抑制腫瘤生長［41］，其機制是Bax蛋白受到刺激后激活caspase3表達，抑制AKT表達，誘導Mcl-1 下調，而刺芒柄花素具有良好的體內耐受性［42］，可能是一種潛在的抗腫瘤化合物。

3.3 BFHX 干預肺結節的潛在機制核心靶點在整個網絡中具有關鍵作用，我們依據degree 值篩選出最關鍵的3個靶點，Jun、AKT1、FOS。Jun原癌基因（c-Jun）、Fos 原癌基因（c-Fos）組成的AP-1轉錄因子復合物通過上調下游靶基因參與了惡性腫瘤的生長、浸潤和轉移過程，在腫瘤的進展與逆轉中起關鍵作用［43］，尤其與肺癌的發生密切相關。c-Jun 通過參與細胞有絲分裂在細胞增殖和致癌轉化中起到重要功能，也是第一種被發現的純致癌轉錄因子，c-Fos 涉及細胞的關鍵功能，包括分化、增殖、生存及受缺氧和血管生成影響的組織穩態［44-45］。SCHREIBER等［46］發現c-Jun通過負調控其啟動因子活性抑制TP53的表達，TP53的負調控可能有助于c-Jun促進致癌轉化的能力。劉曉麗等［47］通過發現c-Jun在Ⅲ～Ⅳ期肺癌組織中陽性表達明顯強于Ⅰ～Ⅱ期，表明c-Jun與肺癌組織的惡性程度密切相關。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-specific protein kinase，AKT）的主要亞型，主要參與細胞分化、增殖和凋亡進程，在包括肺癌在內的多種癌癥中表現出過度活化。研究顯示磨玻璃結節的AKT 酶顯著高于正常對照組織，考慮其可能通過誘導細胞周期蛋白D1表達增加共同起到誘導細胞增殖的作用［48-50］，亦有研究顯示，在Ⅰ型胰島素樣生長因子受體（insulinlike growth factor Ⅰ receptor，IGF-IR）誘導肺腫瘤模型的小鼠體內AKT 水平明顯升高且肺腫瘤表現為單個或多個散在結節［51］，猜測BFHX可能通過抑制AKT1干預肺結節。

3.4 BFHX 干預肺結節的潛在通路通過KEGG 富集分析，我們發現脂質與動脈粥樣硬化信號通路與肺結節的發生密切相關。一項針對良惡性肺結節患者的血漿代謝組學分析顯示，與良性肺結節患者相比，惡性肺結節患者血漿中的氨基酸代謝、脂質代謝和膽固醇代謝受到嚴重干擾。與健康組相比，良惡性肺結節患者的血漿代謝物檢測到共同的代謝特征，這提示良惡性肺結節有相同的變化趨勢［52］。脂質代謝異常會導致局部脂質堆積，對細胞膜的生物物理性質產生影響［53］，而磷脂參與維持細胞結構和細胞器完整，良惡性肺結節患者血漿磷脂水平下降可能提示磷脂保護作用下降，細胞生物膜和脂質雙分子層遭到破壞。這也與GO 分析發現BFHX 干預肺結節的主要靶點集中在細胞膜、跨膜轉運蛋白復合物上的結論不謀而合。

本研究基于網絡藥理學和分子對技術探討補肺活血膠囊干預肺結節的潛在機制，將中醫整體、辨證思維模式與現代藥理研究方法結合起來，構建了體現中醫藥特點的研究方法。闡明了補肺活血膠囊干預肺結節的可能活性成分及靶標蛋白質的生物功能，通過模擬關鍵藥效物質-靶標蛋白的相互作用揭露了補肺活血膠囊的作用機制。結果表明鞣花酸、芍藥苷、黃芩素、β-谷甾醇等物質可能通過調控Jun、AKT1、FOS 等靶點蛋白，對脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、IL-17、TNF 等信號通路進行干預，發揮抗腫瘤、抗癌細胞增殖、抗炎、抗氧化等作用，為深入研究補肺活血膠囊干預肺結節的活性成分及機制提供了堅實的科學理論基礎。