基于網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接探討益氣活血方治療深靜脈血栓形成的作用機制*

秦曉慧，羅 丹，張 力

1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院,廣西 南寧 530001； 2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）是指血液在深靜脈腔內(nèi)不正常凝結(jié)，阻塞管腔而引起的靜脈回流障礙，多見于大手術(shù)或嚴重創(chuàng)傷、長期臥床、肢體制動、腫瘤患者等。DVT 急性期易并發(fā)嚴重的致死性肺栓塞，慢性期由于靜脈瓣膜功能受損易發(fā)生血栓，危及患者的生命質(zhì)量與安全［1-2］。目前認為DVT的主要原因是靜脈血流滯緩、靜脈壁損傷和血液高凝狀態(tài)［3］，現(xiàn)代醫(yī)學治療方法主要有抗凝、溶栓、手術(shù)取栓、放置下腔靜脈濾器等［4］。

深靜脈血栓屬中醫(yī)學“股腫”“瘀血流注”及“脈痹”等范疇［5］，其病位在血脈，脈絡(luò)血瘀貫穿于DVT 的始終［6］。中醫(yī)藥治療DVT 具有綜合調(diào)控的優(yōu)勢，中藥組方中多種成分可通過多途徑、多靶點協(xié)同發(fā)揮復雜生物學作用。益氣活血方是院內(nèi)制劑，遵《醫(yī)林改錯》“氣虛血必瘀”之旨，在血府逐瘀湯的基礎(chǔ)上加減化裁而成。本方由桃仁、紅花、生地黃、川芎、當歸、赤芍、柴胡、枳殼、甘草、黃芪、水蛭、牛膝等藥味組成，有益氣化瘀、活血通脈之效，臨床上用于治療DVT，在溶栓、抗凝、保護血管內(nèi)膜、減輕血栓形成后炎癥反應(yīng)等方面收效良好［7-8］，且安全性高，患者依從性好，在臨床治療DVT 中逐漸得到推廣應(yīng)用［9］。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，對益氣活血方的有效活性成分及其治療DVT 的潛在作用靶點、信號通路進行預測，并采用分子對接技術(shù)進行評估驗證，為益氣活血方后續(xù)臨床及實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益氣活血方活性成分和靶點篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，https：//www.tcmsp-e.com），以“黃芪”“甘草”“枳殼”“柴胡”“牛膝”“赤芍”“川芎”“當歸”“生地黃”“紅花”“桃仁”為關(guān)鍵詞，進行檢索，設(shè)定參數(shù)口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18進行初步篩選，獲得相應(yīng)藥物的有效活性成分；在數(shù)據(jù)庫中輸入化合物成分，獲得益氣活血方中化合物成分對應(yīng)的靶點。由于TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄水蛭，所以以“水蛭”為關(guān)鍵詞，通過中藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/）搜集其成分，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根據(jù)成分名稱查詢相應(yīng)的InChIKey，將得到的InChIKey通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行靶點提取。使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org），把篩選的靶點規(guī)范為人源（Homo sapiens）的標準因，得到其Gene ID作為靶點標準化名稱。

1.2 DVT 相關(guān)靶點篩選使用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www. genecards. org）以“deep vein thrombosis”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得疾病相關(guān)靶點。

1.3 益氣活血方-DVT 潛在交集靶點的獲取將收集到的藥物和疾病的相關(guān)靶點上傳至Venny2.1在線軟件作圖工具平臺（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），在線得到兩者的交集，作為藥物-疾病潛在交集靶點。

1.4 潛在交集靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將“1.3”項所得的潛在交集靶點輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org）中進行檢索，物種來源選擇“Homo sapiens”，在設(shè)定中將互作分數(shù)值設(shè)置為最高置信度0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點，獲取靶點互作的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，繪制蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction，PPI）。

1.5 GO、KEGG 富集分析將益氣活血方治療DVT的潛在靶點上傳至生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/），在線進行基因本體論（gene ontology，GO）。生物學過程富集分析和基于京都基因與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集分析。

1.6 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析將益氣活血方中藥物的活性成分，以及藥物-疾病潛在作用靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對接驗證從PubChem 數(shù)據(jù)庫、PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）檢索并下載核心化合物和關(guān)鍵作用靶點的3D 結(jié)構(gòu)。通過PyMOL 軟件，對核心活性成分和關(guān)鍵作用靶點的3D 結(jié)構(gòu)進行去水、加氫，轉(zhuǎn)換成pdbqt 格式。由autodock vina 1.1.2 軟件完成分子對接分析。最后運用PyMOL軟件將對接結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點與疾病靶點的篩選結(jié)果及處理通過TCMSP、TCMID、Pubchem 數(shù)據(jù)庫，按照“1.1”項的方法獲得益氣活血方的有效成分，把它們對應(yīng)的靶點輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫，刪除去重后，最終得到155個潛在活性成分，篩選出246個藥物靶點。以“deep vein thrombosis”為關(guān)鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得疾病相關(guān)靶點1977 個。使用Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺對中藥靶點與疾病靶點取交集，獲得二者交集靶點162個。見圖1。

圖1 益氣活血方-DVT靶點韋恩圖

2.2 構(gòu)建藥物-疾病潛在作用靶點蛋白-蛋白PPl關(guān)鍵靶點提取利用Cytoscape 3.7.2 軟件，導入“2.1”項所得的藥物-疾病潛在作用靶點162個，構(gòu)建藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖2。

圖2 益氣活血方-DVT靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

從圖中可知，益氣活血方不僅作用于多靶點，還會通過影響靶點之間的潛在作用關(guān)系，共同發(fā)揮治療作用。

在藥物-PPI 網(wǎng)絡(luò)中，共有162 個節(jié)點，750 條邊，Degree 平均值為9.26。Degree 為節(jié)點的自由度，表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點直接作用的節(jié)點數(shù)目，自由度越大則生物學重要性越強。本文提取了自由度前30的潛在作用靶點，以獲得藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點，可視化結(jié)果如見圖3。

圖3 藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點

研究發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、表皮生長因子受體等作用靶點在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵性作用。

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 為進一步探究益氣活血方中有效成分靶點的基因功能，基于David 數(shù)據(jù)庫對其進行GO 功能富集分析，共獲得P＜0.05 的條目2577 條，包括：1）生物過程（Biological process，BP）2304 條。主要包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、細胞對化學應(yīng)激的反應(yīng)、調(diào)節(jié)DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、凋亡信號通路調(diào)控等方面。2）細胞組分（cellular component，CC）59 條。主要在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊腔、胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒腔、小窩、核染色質(zhì)等靶點富集相對集中。3）分子功能（molecular function，MF）159條。

將所得GO 富集分析進可視化處理，取各項靶點的前30個作成條形圖，結(jié)果如圖4—6所示。其中，p.adjust 代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。

圖4 藥物-疾病的GO富集分析圖（BP）

圖5 藥物-疾病的GO富集分析圖（CC）

圖6 藥物-疾病的GO富集分析圖（MF）

2.3.2 KEGG 富集分析 通過David 數(shù)據(jù)庫，對益氣活血方的靶點在信號通路中的作用進行KEGG通路富集分析。KEGG分析結(jié)果表明，162個相關(guān)靶點共參與了168 條信號通路過程，包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、糖基化終末產(chǎn)物/糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end products/receptor for advanced glycation end products，AGE/RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路、缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、C 型凝集素受體信號通路、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性及多種癌癥相關(guān)通路等。篩選排名前30 位的信號通路，采用Omic-Share軟件繪制通路信息圖，結(jié)果如圖7所示。其中，氣泡圖節(jié)點大小和顏色由相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量和P值決定，節(jié)點從小到大反映了相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量由少到多，顏色從藍色轉(zhuǎn)變紅色反映了P值逐漸減小。見圖7。

圖7 前30位的信號通路信息圖

2.4 藥物-有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建采用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖8 所示，圓形節(jié)點代表益氣活血方中的中藥，六邊形節(jié)點代表藥物有效成分，V 型節(jié)點代表潛在作用靶點，三角形代表信號通路。藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)共由359 個節(jié)點組成，包含2373 條邊。研究發(fā)現(xiàn)該方的核心成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、異鼠李素、木犀草素等，可能通過作用于STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGFA、IL-6等靶點和PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路、白細胞介素17 信號通路等達到治療DVT的作用。

2.5 分子對接從Pubchem和PDB數(shù)據(jù)庫分別獲取核心化合物的3D結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵作用靶點的晶體結(jié)構(gòu)。其中，MAPK1 的PDB ID 為：4G6O；VEGFA 的PDB ID為：3QTK。將核心活性化合物和關(guān)鍵作用靶點的3D結(jié)構(gòu)加氫去水去配體，再通過autodock vina1.1.2軟件進行分子對接分析。結(jié)果表明，益氣活血方的核心活性成分與MAPK1、VEGFA 的分子對接結(jié)合能均遠小于-5 kcal/mol；與MAPK1 結(jié)合能最低的化合物分別為槲皮素（結(jié)合能為-8.0 kcal/mol）、異鼠李素（結(jié)合能為-7.9k cal/mol）、山柰酚（結(jié)合能為-7.9 kcal/mol）、β-谷甾醇（結(jié)合能為-6.8 kcal/mol）。與VEGFA結(jié)合能最低的化合物分別為槲皮素（結(jié)合能為-8.5 kcal/mol）、異鼠李素（結(jié)合能為-8.5 kcal/mol）、山柰酚（結(jié)合能為-8.1 kcal/mol）、β-谷甾醇（結(jié)合能為-7.6 kcal/mol）。結(jié)果表明：槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、山柰酚與潛在靶點高效結(jié)合，結(jié)合能低，構(gòu)象穩(wěn)定，相應(yīng)的結(jié)果見圖9、表1。

圖9 分子對接示意圖

3 討論

《金匱要略》提出“血不利則為水”，張景岳認為：“凡治腫者，必先治水；治水者，必先治氣。”《醫(yī)林改錯》中指出“氣虛血必瘀”，故本病基本病機為氣虛血瘀，瘀阻脈絡(luò)，根據(jù)“氣為血之帥，血為氣之母”的理論，氣能生血、攝血、行血，調(diào)暢氣機，故治宜益氣祛瘀、活血通脈。益氣活血方以血府逐瘀湯為基礎(chǔ)加減補氣、破瘀之品，共奏益氣活血通脈之效。

3.1 益氣活血方的有效成分通過“藥物-有效成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)”圖可知槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、山柰酚、木犀草素等為益氣活血方治療DVT 的重要有效成分。槲皮素不僅能降低血小板的高度聚集、減少血小板顆粒的胞外分泌，還可以抑制凝血酶和人內(nèi)皮細胞的激活因子X 的活性，減少纖維蛋白凝塊和血液凝塊的形成，起到抗凝和抗血栓作用［10-12］。β-谷甾醇主要有抗氧化、抗炎、降血脂和抗腫瘤等作用［13］，能通過降低毛細血管通透性起到抗炎作用，從而保護血管［14］；β-谷甾醇具有溶栓活性，在體內(nèi)能夠發(fā)揮抗凝活性，有助于預防血栓形成［15］。異鼠李素具有抗炎、抗氧化、抗血栓、保護血管內(nèi)皮、抗腫瘤等廣泛的藥理作用［16-17］，異鼠李素作用核因子κB、信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子1 而影響誘導一氧化氮合酶的活性，起到抗炎作用，從而保護血管內(nèi)皮的完整性，還能抑制血小板聚集及血小板激活時必要的活性膠原成分形成，起到抑制血小板凝集及抗血栓的作用［18］。山柰酚具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等功效［19］，能夠抑制凝血酶活性、抑制纖維蛋白聚合物的形成，還能使凝血時間延長，從而減少或防止血栓形成［20］。

3.2 作用關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖提示益氣活血方治療DVT 的主要靶蛋白有STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGFA、IL-6 等。STAT3 可調(diào)節(jié)膠原誘導的血小板活化和聚集，有可能使血小板在炎癥條件下過度活躍，如IL-6 可增強膠原誘導的STAT3 激活［21］。STAT3 磷酸化可調(diào)節(jié)TXA2 受體活性，從而調(diào)控血小板的活化［22］。MAPK1 和MAPK3 可通過調(diào)控炎癥細胞增殖、分化和凋亡，減少血管損傷［23-24］，此外二者也是VEGF 信號通路中的關(guān)鍵靶點，可參與血管內(nèi)皮細胞的分裂和遷徙，促進血管生成［25］。VEGFA 是最主要的血管內(nèi)皮生長因子，可調(diào)控內(nèi)皮祖細胞［26］，促進受損的血管內(nèi)膜修復和血管生成［27］。IL-6 是一種促炎和免疫調(diào)節(jié)因子；DVT 中IL-6 表達增加，MiR-338-5p 可抑制其表達從而減輕炎癥，從而有效減少血栓大小和重量，并達到保護血管內(nèi)皮細胞的功能［28］；研究表明血栓溶解過程中IL-6 可以誘導巨噬細胞表達CCL2，從而促進巨噬細胞的浸潤，參與血栓溶解［29］。

3.3 信號通路KEGG 富集分析結(jié)果表明，益氣活血方治療DVT 主要與PI3K/Akt 通路、MAPK 通路、TNF通路、IL-17通路、HIF-1通路等密切相關(guān)。PI3K/Akt 信號通路與細胞生命活動密切相關(guān)，主要發(fā)揮促進增殖、保護、抗凋亡的作用［30］。PI3K/Akt信號通路可通過上調(diào)炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-8 等 的蛋白表達，從而促進DVT 的形成［31］。MiR-9-5p 通過介導PI3K/Akt 自噬途徑促進EPC 增殖、遷移和血管生成，從而促進血栓溶解，加速血栓再通［32］。MAPK 信號通路是調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)錄、分化和凋亡的基本信號通路［33］。PDK1可通過調(diào)節(jié)MAPK 通路中Raf1 的激活來調(diào)控血小板血栓素的生成和血栓形成［34］。抗β2GPI/β2GPI復合物可誘導血小板活化，并通過p38MAPK 途徑促進血栓形成［35］。丹皮酚通過ERK1/2MAPK 信號通路誘導VEGF165 促進血栓再通［36］。TNF-α 可激活靶細胞刺激組織因子的生成和釋放，抑制纖溶系統(tǒng)相關(guān)因子的合成，并誘導細胞黏附因子的合成與釋放［37］。IL-17可介導自身免疫和炎癥反應(yīng)［38］，它作為免疫應(yīng)答介質(zhì)，可損傷血管內(nèi)皮細胞［39］。IL-17 和TNF-α 相結(jié)合時可增加血小板聚集，抑制抗凝作用，導致血栓形成［40］。缺氧條件下，缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達升高，能加快下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，介導血管生成［41-42］。

本研究結(jié)果表明，益氣活血方中的槲皮素、β-谷甾醇、異鼠李素、山柰酚等主要活性成分，可能作用于STAT3、MAPK1、MAPK3、VEGF-A、IL-6 等多個靶點，干預PI3K/Akt、MAPK、HIF-1、IL-17 等信號通路，從而調(diào)控機體炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答、影響血管內(nèi)血小板聚集及血栓形成、減少細胞缺氧損傷、保護血管內(nèi)皮，從而發(fā)揮治療DVT的作用。