丹參素對胃癌AGS細胞凋亡的影響及其機制研究*

鄧 帥，周桂香，郭小峰，譚 寶

（1.山西中醫藥大學，山西 太原 030024；2.山西省中醫院，山西 太原 030000）

胃癌在人類消化系統癌癥中較為普遍，其發病率和死亡率均高居不下。在全球范圍內，胃癌的發生率約占全部腫瘤病例的5.6%，排于世界第五位；死亡率低于肺癌、結直腸癌、肝癌，位列世界第四位[1]。近年來，研究[2]發現丹參內的生物活性成分具有抗腫瘤的作用，并對胃癌也有較好的抑制效果。丹參素是丹參內的生物活性成分之一，在體內能夠發揮抗氧化、消炎、抑癌、活血化瘀等藥理作用[3]。已有實驗證明丹參素對胃癌具有抑制作用，但對其作用機制尚不清楚[4]，本研究旨在探討丹參素對人胃腺癌AGS細胞凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人胃腺癌AGS細胞株，受贈于上海中醫藥大學課題組。

1.2 試劑及儀器 DMEM培養基（批號：MA0212）、CCK8試劑盒（批號：SC119-02）均購買于正合生物公司；順鉑注射液（批號：601210605）購買于江蘇豪森藥業；丹參素標準品（批號：MUST-21060920）購買于成都曼斯特生物科技公司；BCA蛋白濃度測定試劑（批號：16H10A46）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（變性）（5X)（批號：16J20B12）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號：16J27C38）均購買于博士德生物公司；胎牛血清（批號：21090706）購買于四季青生物公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號：Jan-18G）、Mei Lunbio飛克特超敏EGL發光液（批號：MA0186-Sep-17G）均購買于大連美倫公司；細胞周期染色試劑盒（批號：A10734）購買于北京聯科公司；Bax、BCL-2抗體（批號：3560006120、3560138106）均購買于thermo公司。

TD5A-WS型低速離心機（中科中佳有限公司）；DYY-2C型電泳儀（北京六一公司）；RT-6100型酶標儀（MoLecuLar Devices公司）；BD-C6型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一公司）；3111型細胞恒溫培養箱（thermo公司）；CJ-2F型超凈工作臺（北京東聯哈爾公司）。

1.3 藥物配制 于電子天平上準確稱取4 mg丹參素標準品，溶解于DMEM培養基中，配得200 μg/mL的丹參素溶液，按濃度稀釋，得到丹參素濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的溶液。

1.4 胃癌AGS細胞培養 用DMEM培養基（含10%胎牛血清、1%雙抗）培養人胃癌AGS細胞，將其放于恒溫箱中生長（溫度為37 ℃，CO2含量為5%），傳代條件為培養液顏色變淺或細胞貼至瓶底70%～100%。

1.5 細胞增殖抑制率檢測 將胃癌AGS細胞按6×104/mL的密度接種在96孔板內，每孔放置100 μL細胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液及濃度為5 μg/mL的順鉑注射液溶液（陽性組）各100 μL，另取5個副孔只加入100 μL培養基，設為空白對照組，放于恒溫箱24、48 h后，加入110 μL的CCK-8工作混合液，放于恒溫箱孵育30 min，在酶標儀上測出450 nm處光密度（opticaL density，OD）值后，計算其抑制率。抑制率=[OD（Ac）-OD（As）]/[OD（Ac）-OD（Ab）]×100。As（含藥組，含有藥物、細胞、CCK8溶液、培養基），Ab（空白對照組，含有培養基、CCK8溶液，不含藥物及細胞），Ac（空白組，含有細胞、培養基、CCK8溶液，不含藥物）。實驗重復3次。

1.6 細胞周期檢測 將胃癌AGS細胞按2×105/mL的密度接種在6孔板內，每孔放置2 mL細胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液各2 mL，干預胃癌AGS細胞24 h、48 h后，胰酶消化、離心、PBS重懸、最后使用預冷的無水乙醇固定細胞。在檢測時離心細胞，棄去含有無水乙醇的上清液，加入2 mL的PBS靜置15 min后離心，吸出上清液并丟棄，加入1 mL DNA staining solution后放于暗處避光30 min后上機檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測 將胃癌AGS細胞按2×105/mL的密度接種在6孔板內，每孔放置2 mL細胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液各2 mL，干預胃癌AGS細胞24 h、48 h后，分別進行以下步驟操作：胰酶消化、離心、棄上清液、加預冷PBS后離心、棄上清液、加200 μL Bing Buffer重懸細胞、吸取一半重懸細胞放于流式管中、加入5 μL AV和10 μL PI、避光15 min、加入400 μL Bing Buffer后上機檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.8 Western blotting檢測蛋白表達情況 將胃癌AGS細胞按4×105/mL的密度接種在6孔板內，每孔放置2 mL細胞懸液，待其貼壁后，分別給予濃度為0 μg/mL（空白組）、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的丹參素溶液及濃度為5 μg/mL的順鉑注射液（陽性組）各2 mL干預胃癌AGS細胞，放于恒溫箱培養24 h后對細胞進行收集，于冰上對細胞進行裂解，裂解完成后在低溫離心機上進行離心，待結束后對蛋白進行提取并對所得蛋白定量分析，煮沸并收集變性蛋白，計算上樣量。然后按照配膠、上樣、電泳、轉PVDF膜這一順序收集轉膜成功的PVDF膜，將膜放于牛奶中封閉，于2h后用TBST每隔10 min對其進行清洗，共計3次，加入稀釋500倍的一抗后放于4 ℃冰箱過夜，第2天依法洗膜3次放于稀釋5 000倍的二抗中，1 h后依法洗膜3次，最后加入ECL發光液行顯影分析。

1.9 統計學方法 從Excel數據表中導入數據信息，用SPSS 25.0軟件統計分析，計量數據使用“均數±標準差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 丹參素對胃癌AGS細胞增殖抑制率的影響 除空白組外，丹參素同一濃度不同時間段對胃癌AGS細胞均具有抑制作用，其抑制率隨著藥物的作用時間延長而逐漸升高（P<0.05），說明丹參素對胃癌AGS細胞的抑制具有時間依賴關系；與空白組比較，低、中、高濃度組的丹參素干預胃癌AGS細胞24 h，可使胃癌AGS細胞抑制率從8.10%上升到24.21%，干預胃癌AGS細胞48h，可使胃癌AGS細胞抑制率從15.24%上升到47.45%（P<0.05），說明丹參素對胃癌AGS細胞的抑制具有濃度依賴關系。陽性組對胃癌AGS細胞的抑制率明顯高于高濃度組（P<0.05)。結果表明丹參素干預胃癌AGS細胞24、48 h，能呈劑量和時間依賴性地抑制胃癌AGS細胞的生長。而陽性組對胃癌AGS的抑制率優于丹參素。（見表1）

表1 丹參素對胃癌AGS 細胞增殖抑制率的影響 （x±s,%）

2.2 丹參素對胃癌AGS細胞凋亡的影響 丹參素干預胃癌AGS細胞24 h凋亡率如圖1所示，與空白組比較，低、中、高濃度組丹參素干預胃癌AGS細胞后凋亡率分別為6.4%、12.2%、23.8%；干預胃癌AGS細胞48 h凋亡率如圖2所示，與空白組比較，低、中、高濃度組丹參素干預胃癌AGS細胞后凋亡率分別為12.7%、21.1%、52.5%。結果表明，丹參素對胃癌AGS細胞有促凋亡作用，其凋亡率隨著丹參素濃度的增加而升高（P<0.05）。

圖1 丹參素對胃癌AGS 細胞凋亡的影響（24 h）

圖2 丹參素對胃癌AGS 細胞凋亡的影響（48 h）

2.3 丹參素對胃癌AGS細胞周期的影響 丹參素干預胃癌AGS細胞24 h，對其周期影響如圖3所示，與空白組比較，低、中、高濃度組的丹參素對胃癌AGS細胞G2/M期具有抑制作用，能夠使G2/M期細胞數目顯著增加，其抑制率從27.14%上升到50.26%（P<0.05）。丹參素干預胃癌AGS細胞48 h，對其周期影響如圖4所示，與空白組比較，低、中、高濃度組的丹參素對胃癌AGS細胞G2/M期具有抑制作用，能夠顯著抑制G2/M期的細胞數，其抑制效果從40.94%上升到73.55%（P<0.05）。結果表明，丹參素干預胃癌AGS細胞后能將其周期阻滯于G2/M期。

圖3 丹參素對胃癌AGS 細胞周期的影響（24 h）

圖4 丹參素對胃癌AGS 細胞周期的影響（48 h）

2.4 丹參素對胃癌AGS細胞不同蛋白表達的影響 丹參素干預胃癌AGS細胞后對不同蛋白表達的影響如圖5所示，與空白組比較，低、中、高濃度組丹參素及陽性組對胃癌AGS細胞Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表達具有促進作用（P<0.05），對Bcl-2蛋白的表達具有抑制作用（P<0.05）。與丹參素高濃度組比較，陽性組Bax、Cytochrome C、p53蛋白表達升高明顯，Bcl-2蛋白表達降低明顯（P<0.05）。結果表明丹參素能夠抑制胃癌AGS細胞Bcl-2蛋白的表達，促進Bax、p53、Cytochrome C蛋白的表達，并呈劑量依賴關系。陽性組對胃癌AGS細胞Bcl-2蛋白的抑制效果及對p53、Cytochrome C、Bax蛋白的促進效果較丹參素好。

圖5 丹參素對胃癌AGS 細胞不同蛋白表達的影響

3 討 論

近年來，由于中藥抗癌取得了良好的效果，丹參及其有效成分被發現對胃癌具有較好抑制的效果，但大多是對其脂溶性成分的研究，對其水溶性成分的研究較少[5]。由于丹參素是丹參的水溶性成分之一，因此本實驗采用丹參素作為實驗藥物。研究表明丹參素可以通過調控細胞內的信號因子，來抑制癌細胞生長并對癌細胞的凋亡起著積極作用[6-8]。本實驗通過CCK8試劑檢測證實丹參素可以對胃癌AGS細胞的增殖產生抑制作用，表明丹參素可以抑制胃癌細胞的生長，進一步驗證了丹參素具有抗腫瘤作用。

細胞凋亡具有獨特的生化和遺傳途徑，是細胞受到體內多種信號分子影響所發生的一種程序性細胞死亡，在正常組織的發育和體內平衡中起關鍵作用[9-10]。細胞凋亡受阻可以導致腫瘤發生，調控信號分子可以使細胞凋亡。細胞周期是按照一定順序在細胞內不斷發生的一組事件，細胞能夠正常進行生長與分裂是因為細胞能夠嚴格按照G0/G1→S→G2→M這一順序進行[11-12]。如果細胞周期被阻滯于某一階段，則會導致細胞增殖分化異常，最終凋亡，這表明周期阻滯是藥物發揮抗癌作用的機制之一[13]。楊華等[4]發現丹參素可以通過周期阻滯來促進胃癌細胞凋亡；畢明慧等[14]使用丹參素作用于肝癌細胞后，發現p53高表達對肝癌細胞凋亡起著積極作用；賈金靖等[15]發現丹參素可以通過調控凋亡相關蛋白來控制銀屑樣細胞凋亡；彭汝琴等[16]通過實驗證實丹參素能通過調控Bax、Bcl-2等凋亡蛋白來加速肝星狀細胞凋亡。這提示丹參素可以通過多種途徑來促進癌細胞的凋亡。在本實驗中，將丹參素作用于胃癌AGS細胞后，隨著時間的延長和藥物濃度的增加，細胞凋亡率增加，G2/M期細胞比例上升，由此推斷丹參素能夠通過G2/M期阻滯來抑制胃癌AGS細胞生長，誘導細胞凋亡。

Bax、BCL-2蛋白與線粒體凋亡有著密切關聯，在促進或抑制線粒體功能障礙引發的內在凋亡途徑中起關鍵作用[17]。研究發現Bax/Bcl-2比值發生變化會使膜電位的穩態受到影響，使線粒體膜電位發生改變，導致與線粒體凋亡密切相關的Cytochrome C從線粒體釋放到細胞質與Apaf1結合發生寡聚化，引起Caspase的級聯反應，使凋亡程序開始進行，從而引起細胞凋亡的發生[18-23]。有研究[24-25]發現，DNA的損傷會活化p53。這時p53能夠作為一個上游基因，調控Bax、Bcl-2蛋白表達來強化線粒體凋亡途徑。這表明線粒體凋亡途徑有Bax、Bcl-2、Cytochrome C、p53蛋白參與。在本實驗中，將丹參素作用于胃癌AGS細胞后，p53、Bax、Cytochrome C蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達下降，這表明丹參素促進胃癌AGS細胞凋亡可以通過啟動線粒體凋亡進行。

綜上所述，丹參素能夠抑制胃癌AGS細胞的生長，促進胃癌AGS細胞凋亡，其機制與丹參素阻滯細胞于G2/M期、啟動線粒體凋亡有關。