母源性表達基因8在糖尿病視網膜病變中的作用

王蓄楊, 陳王靈

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種由遺傳和環境因素相互作用而誘發的慢性疾病,其特征是絕對或相對的胰島素缺乏及高血糖、血脂異常和神經血管損傷[1]。這種損害可能影響患者體內的每一個器官或系統,并給患者的家庭和經濟造成嚴重負擔。DM視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是胰島素代謝異常而引發的眼部神經及組織血管微循環改變,是1型和2型DM常見的微血管并發癥,也是DM患者致盲的重要原因[2]。臨床上,根據是否有視網膜新生血管生成,將DR分為非增殖性DR(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。DR發病機制復雜,病情隱匿且早期臨床癥狀不顯著,多數患者出現明顯癥狀時疾病已進入中期甚至更嚴重的階段[3]。因此,探究DR的發病機理、尋找有潛力的DR診斷標記物,對臨床上DR的有效診斷及治療十分必要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的轉錄RNA分子,是轉錄、分化、侵襲、凋亡等多種生物過程的重要調控因子[4]。lncRNA正發展成為多種人類疾病新的生物標記物和治療靶點。既往研究[5-7]報道,lncRNA 人類肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)在DM相關并發癥(視網膜病變、動脈粥樣硬化及妊娠DM)中發揮促炎和促細胞凋亡的作用,因而具有成為DM相關并發癥治療靶點的潛力。lncRNA母源性表達基因8(maternally expressed gene 8,MEG8)最初被發現在肺癌、胰腺癌、結直腸癌和巨細胞瘤等多種腫瘤中表達失調[8]。近年來,有研究[9]發現,MEG8在DM患者的血清中上調,而在DM腎病患者中進一步上調。另一項研究[10]表明,MEG8在妊娠DM患者血清中表達升高,且高水平的MEG8對妊娠DM具有較高的診斷價值。此外,高水平MEG8患者腎損傷發生率較高[11]。本研究旨在通過臨床及細胞水平的實驗,探討MEG8在DR中的表達情況及可能的調控機制。

1 對象與方法

1.1 對象 共納入 179 例受試者,其中DM 59 例,DR 60 例,健康人群 60 例。DM的診斷依據美國糖尿病協會(American Diabetes Association,ADA)于 2017 年制定的標準[12]。DR的診斷參照ADA頒布的診斷指南[13]。選取同期在筆者醫院體檢的 60 例無DM病史和其他眼病家族史的健康人作為對照組。所有受試者均排除惡性腫瘤、心血管疾病、自身免疫疾病。本研究獲得中山大學中山眼科中心海南眼科醫院醫學倫理委員會批準,并遵循《赫爾辛基宣言》中關于人體研究的倫理原則,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理 采集所有受試者靜脈血,高速離心后分離血清,保存于-80 ℃冰箱中備用。人視網膜微血管內皮細胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)購自上海生化與細胞生物學研究所(上海SIBCB公司)。培養條件:DMEM/F12培養基內含10%胎牛血清和內皮生長因子(30 mg/mL),于37 ℃體積分數為0.05的CO2培養箱中孵育。通過高糖誘導HRMECs構建體外增殖型DR細胞模型[14]。DR組采用30.0 mmol/L的高糖誘導細胞24 h,對照組采用5.5 mmol/L的高糖處理細胞24 h。將 2 組細胞置于37 ℃、體積分數為0.05的 CO2潮濕培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染 細胞接種到12孔板中,培養過夜。使用Lipofectamine 2000將si-MEG8、si-NC、miR-15a-5p mimic、miR-NC、miR-15a-5p inhibitor和inhibitor-NC轉染到HRMECs細胞中。

1.2.3 RNA提取及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR) 采用TRIzol 法提取并純化血清和HRMECs細胞中的總RNA。采用SuperScript Ⅱ逆轉錄酶試劑盒和PrimeScript RT試劑盒進行cDNA的合成。利用miScript SYBR Green PCR試劑盒在Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR System上進行cDNA的擴增。用GAPDH和U6分別對MEG8和miR-15a-5p進行歸一化,并采用2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。

1.2.4 CCK-8實驗 采用CCK-8法測定細胞活力。將HRMECs細胞以5×104個/孔的密度接種到96孔板中。在每一個預先設定的時間點0、24、48和72 h時,向每孔中加入CCK-8溶液10 μL和新鮮無血清培養液90 μL,暗處孵育2 h后,用酶標儀檢測450 nm處的光密度(optical density, OD)值。

1.2.5 Transwell實驗 使用Transwell小室進行HRMECs的細胞遷移分析。收集轉染完成的細胞,將其分散在200 μL無血清的培養基中,將細胞接種到上腔室。同時在下腔室中加入800 μL含10%胎牛血清的DMEM培養基。將上述Tranwell小室置于37 ℃培養箱中培養24 h后,用甲醇固定遷移至插入物下方的細胞,室溫下用0.1%結晶紫染色。在倒置熒光顯微鏡下隨機選取 5 個視野對遷移細胞進行計數。

1.2.6 熒光素酶報告基因 StarBase v2.0在線程序預測到MEG8和miR-15a-5p的3’-UTR區具有互補結合位點,采用熒光素酶報告基因驗證MEG8和miR-15a-5p的相互作用。將MEG8的3’-UTR片段克隆到pGL3熒光素酶報告載體中,構建野生型(wild-type, WT)報告載體MEG8 3’-UTR-WT和突變型(mutant-type, MUT)報告載體MEG8 3’-UTR-MUT。根據Lipofectamine 2000的產品說明,將上述載體與miR-15a-5p mimic/inhibitor、mimic/inhibitor-NC共轉染HRMECs細胞。轉染48 h后,收集細胞并利用雙熒光素酶報告系統測定HRMECs細胞的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 人口及臨床資料 所有受試人員的基線資料及臨床數據均見表1。3 組受試者的性別、年齡、體質量指數(body mass index, BMI)、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、收縮壓和舒張壓等指標比較,差別無統計學意義(P>0.05)。DM、DR組與對照組的糖化血紅蛋白、空腹血糖、胰島素抵抗指數和DM病程等指標比較,差別有統計學意義(P<0.05)。

表1 3組受試者的基本信息

2.2MEG8在DM、DR組中的表達水平及對DM和DR的診斷價值分析 采用qRT-PCR檢測受試者血清中MEG8的表達水平。與對照組比較,DM組血清MEG8的表達水平明顯增高(P<0.001)。DR組的MEG8水平較DM組和對照組更高,差別有統計學意義(P<0.001,圖1A)。建立ROC曲線評價MEG8對DM和DR的診斷價值,該曲線的曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.862,敏感度為85.5%,特異度為80.0%,初步表明MEG8對DM的診斷準確性較高(圖1B)。另外,在DM和DR患者中,血清MEG8同樣展現出較高的臨床診斷價值,其ROC曲線的AUC為0.918,敏感度和特異度分別為83.3%和80.6%(圖1C)。

lncRNA:長鏈非編碼RNA;MEG8:母源性表達基因8;DM:糖尿病;DR:糖尿病視網膜病變。A:血清MEG8的表達水平(與對照組比較,☆:P<0.001;與DM組比較,△:P<0.001);B:對照組、DM組MEG8表達水平的ROC曲線;C:DM、DR組MEG8表達水平的ROC曲線。

2.3 血清MEG8水平與臨床指標的相關性 為進一步驗證MEG8異常表達與DR的關系,采用Pearson相關系數評估MEG8與臨床指標的相關性。MEG8水平與患者的病程、糖化血紅蛋白水平、空腹血糖水平及胰島素抵抗指數呈顯著正相關(P<0.01,表2)。

表2 lncRNA MEG8與部分臨床指標的相關性

2.4MEG8的表達水平對細胞增殖和遷移的影響 本研究采用高糖誘導HRMECs細胞構建體外DR細胞模型。與對照組比較,高糖誘導組細胞的MEG8的表達水平顯著上調,而細胞轉染MEG8小干擾RNA后明顯降低了高糖誘導所致的HRMECs細胞內MEG8升高(P<0.001)。細胞增殖和遷移實驗的結果表明,高糖誘導能顯著促進HRMECs細胞的增殖和遷移能力,抑制MEG8則可逆轉高糖環境對細胞增殖和遷移的促進作用(P<0.001,圖2)。

lncRNA:長鏈非編碼RNA;MEG8:母源性表達基因8。A:細胞建模及轉染;B:細胞活力;C:細胞遷移。與對照組比較,☆:P<0.001;與高糖組比較,◇:P<0.001。

2.5MEG8直接靶向miR-15a-5p并負調控miR-15a-5p的表達水平 為進一步確定MEG8在DR中的作用機制,采用StarBase v2.0數據庫進行生物信息學分析。該數據庫預測到miR-15a-5p與MEG8的3’-UTR有結合位點,二者的互補序列見圖3A。熒光素酶報告基因結果顯示,當細胞轉染miR-15a-5p模擬物后,MEG8-3’-UTR-WT組的熒光素酶活性顯著降低,而轉染miR-15a-5p抑制劑后,MEG8-3’-UTR-WT組的熒光素酶活性增高(P<0.001,圖3B)。此外,細胞轉染miR-15a-5p模擬物或miR-15a-5p抑制劑均對MEG8-3’-UTR-MUT組的熒光素酶活性無影響。筆者初步確定miR-15a-5p是MEG8的直接靶基因,并受到MEG8的負調控。據此,對臨床受試者的血清miR-15a-5p的水平進行檢測,結果發現,DM組和DR組患者血清miR-15a-5p的表達與MEG8的表達趨勢相反,即DR患者血清miR-15a-5p水平顯著低于對照組和DM組,差別具有統計學意義(P<0.001,圖3C)。Pearson相關系數提示,miR-15a-5p的表達與MEG8水平呈負相關(P<0.001,圖3D)。另外,高糖誘導細胞后胞內miR-15a-5p的表達水平明顯降低,而抑制MEG8的表達則相應促進miR-15a-5p的表達水平(P<0.001,圖3E)。以上結果進一步證實,MEG8與miR-15a-5p在體外DR細胞模型中的關系。

pmirGLO Vector:熒光素酶報告質粒載體;PGK:磷酸甘油酸激酶;Luciferase:熒光素酶;MEG8:母源性表達基因8;3’-UTR:3’-非翻譯區;WT:野生型;MUT:突變型;hsa-miR-15a-5p:人源miR-15a-5p;lncRNA:長鏈非編碼RNA。A:MEG8與miR-15a-5p的互補結合位點;B:熒光素酶報告基因實驗;C:血清miR-15a-5p的表達水平;D:Pearson相關系數分析;E:細胞模型中miR-15a-5p的水平。與對照組比較,☆:P<0.001;與DM組比較,△:P<0.001;與高糖組比較,◇:P<0.001。

3 討 論

DR是導致失明的重要眼病之一。在DR發展過程中,可以發現許多特征性的視網膜異常,包括微動脈瘤、印跡出血、棉毛斑和視網膜靜脈擴張等,這些被認為是微血管損傷的特征[15]。目前,DR的發病機制尚不完全清楚,一般認為是由于糖代謝紊亂導致視網膜微血管系統受損所致[16]。多年來,DNA、RNA和蛋白質的功能失調被認為是包括DM在內的人類疾病發生和發展的主要因素。lncRNA 在DR中的作用是一個相對新的探索領域,對其在疾病發病過程中改變分子和細胞過程機制的研究至關重要。

lncRNAMEG8位于人類14號染色體上的δ樣1 同源脫碘酶-碘甲狀腺原氨酸3印記區內,已知該印記區對人類疾病具有重要的調控作用[17]。TERASHIMA等[18]的研究發現,在人肺癌細胞株中,MEG8參與介導上皮間質轉化,對腫瘤的發生具有重要意義。ZHANG等[19]發現,在氧化低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞中,MEG8通過海綿作用miR-181a-5p促進α-過氧化物酶體增殖物激活受體蛋白的表達,從而調控血管平滑肌細胞的增殖、遷移和凋亡,在動脈粥樣硬化中發揮重要作用。本研究發現,MEG8在DM患者血清中表達升高,而在DR患者血清中表達進一步升高。MEG8的表達水平與DR患者的病程等臨床指標呈正相關,且MEG8對DR表現出良好的診斷性能。這些結果提示,MEG8可能在DR的發病過程中發揮一定的調控作用。

DR是引起視力損傷及失明的主要原因。大劑量葡萄糖的持續誘導可致HRMECs的凋亡增加,而HRMECs的增殖、遷移及誘導血管新生是DR進展的重要因素[20]。高靜等[21]的研究表明,血管內皮生長因子、基質細胞衍生因子-1的表達促進了HRMECs的增殖和遷移能力,并抑制了HRMECs的凋亡水平,因而可能在DM導致的血管病變中發揮促進作用,故本研究通過高糖誘導構建增殖型DR的體外細胞模型。高糖誘導導致HRMECs內MEG8的表達升高。同時,高糖誘導促進了HRMECs的增殖和遷移能力。下調MEG8的水平能明顯逆轉高糖誘導對細胞增殖和遷移的促進作用。因此,抑制MEG8的表達水平可緩解高糖對HRMECs細胞功能的不利影響。

研究[22]顯示,lncRNA對miRNA的調控作用可通過控制miRNA的表達來影響其靶基因的表達量,其與miRNA結合從而阻止miRNA與其靶mRNA結合,作為miRNA的靶點或分子海綿而發揮基因調節的作用。既往的研究[23]表明,心肌梗死相關轉錄本(myocardial infarction associated transcript, MIAT)作為miR-342-3p的分子海綿,通過與miR-342-3p的靶向結合,調控胱天蛋白酶1的表達,進而誘導人視網膜周細胞(human peripheral retinal cellsh,HRPCs)的焦亡,從而發揮調控DR的作用。本研究中,靶基因預測及熒光素酶報告基因實驗證明miR-15a-5p與MEG8具有互補結合位點并且二者為靶標關系。此前,miR-15a-5p(又稱為miR-15a)被認為對DM患者的胰島素抵抗有緩解作用[24]。GONG等[25]的研究發現,高糖培養的視網膜組織細胞中miR-15a-5p的表達水平顯著降低,且當HRMECs細胞暴露于高糖環境中時,上調的VEGF通過下調miR-15a-5p促進了高糖對細胞的損傷;而MASTROPASQUA等[26]的研究發現,DM患者無論是否有DR,循環miR-15a-5p水平均明顯降低。筆者推測,在高糖處理的HRMECs中,上調的MEG8可能通過下調miR-15a-5p發揮了促進HRMECs增殖和遷移的作用。

本研究的局限性在于:首先,樣本量較小,來源單一且均為筆者醫院周邊的人群,可能存在一些無法完全避免的選擇偏差;其次,在DR人群的納入中,未對這一部分人群進行臨床分期,即病情嚴重與病情輕微的患者均在同組中,這也導致MEG8的表達情況與疾病嚴重程度的關系不能被直觀看到。因此,在后續的研究中,筆者會進一步擴大樣本量及樣本來源,并針對DR的分期進行基因表達與疾病分期關系的研究。

綜上所述,DM患者血清MEG8水平升高,而DR患者血清MEG8水平進一步上升。異常升高的MEG8展現出對DR和DM良好的辨別能力,表明MEG8對DR具有較高的診斷準確性,有成為DR診斷生物標記物的潛力,對于DR的診斷可能具有一定的輔助作用。同時,體外細胞實驗表明,MEG8直接靶向miR-15a-5p。在細胞水平上,高表達的MEG8可能通過靶向miR-15a-5p發揮促進高糖誘導HRMECs的增殖和遷移的作用。