中藥單體及復方抗腎小管上皮細胞轉分化的研究進展

崔童(綜述), 樓曉慧, 陳亞萍, 南麗紅(審校)

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是一個不可逆的疾病進展過程,最終會發展為腎衰竭,進入終末期腎病。目前,CKD患者數量逐年增多,全球CKD患者達8%～16%,故CKD已成為全球公共健康問題,嚴重威脅人類健康[1]。腎間質纖維化(rental interstitial fibrosis, RIF)是各種腎臟疾病發展過程中關鍵的病理基礎,而腎小管上皮細胞(renal tubular epithelical cells, RTECs)間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是發生RIF的核心環節[2]。因此,合理干預EMT可有效降低RIF發生。

1 EMT的概述

EMT是指在一定條件下,上皮細胞失去原有的表型,獲得間充質細胞的形態和特征的過程,在組織纖維化的發生、發展中發揮重要作用[3]。EMT的發生涉及多個信號通路,由一系列的細胞因子和生長因子共同參與,使上皮細胞獲得間充質細胞的特性,轉分化為成纖維細胞(fibroblast, FB),并通過增殖和活化成為肌成纖維細胞(myofibroblast, MFB),合成分泌大量的細胞外基質(extracellular matrix, ECM),促進纖維化的形成[4]。1995年,STRUTZ等[5]在受損的RTECs中檢測到異常表達的FB特異性蛋白1,首次提出了腎小管EMT。譜系追蹤實驗證明36%的MFB來源于RTECs,認為RTECs EMT 是產生MFB的主要機制[6]。另有研究[7-8]發現,在 EMT 過程中,RTECs 可不完全通過轉分化為MFB促進纖維化,還可通過損傷RTECs的吸收和分泌功能,誘導細胞周期停滯在 G2/M 期,分泌促纖維化因子,進而影響 RIF 的進程。因此,通過調控 EMT 的發生、發展,可成為延緩 RIF 的有效靶點。

2 EMT 的過程

EMT 是 RIF 的早期發病機制,其發生的主要過程包括上皮細胞失去黏附特性、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達和重組、腎小管基底膜的破壞、細胞遷移和侵襲能力增強[9],其主要特征可概括為:(1)細胞的極性消失。上皮細胞具有端-基極性,可固定于基底膜上。當上皮細胞轉化為FB時,細胞的極性就會消失。(2)細胞間緊密消失。正常情況下,RTECs通過細胞間黏附分子與其他細胞緊密連接。在致病因素的作用下,細胞間黏附分子的表達受到抑制,導致細胞間緊密連接消失[10]。(3)E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表達減少。E-cad 參與黏附連接的形成和上皮細胞的連接,建立和維持上皮細胞極性和細胞間結構的完整性。EMT 發生時,伴隨細胞極性的消失和細胞間緊密消失,E-cad表達減少[11]。(4)α-SMA 表達增加。在病理狀態下,RTECs發生EMT,FB增殖活化,細胞表型發生改變,成為表達 α-SMA 的MFB[12]。(5)細胞遷移和侵襲能力增加。在EMT的過程中,基底膜斷裂,MFB可獲得更強的遷移和侵襲能力,遷移至腎間質區,分泌并合成ECM,加速 RIF 的發展[13]。

3 中藥抗 EMT 的研究

中藥防治 RIF 具有豐富的理論依據和治療經驗,已表現出其獨特的優勢。近幾年來,許多中藥治療腎臟病的機制研究開始聚焦于 EMT,中藥可以通過調控 EMT 延緩 RIF 的進程,從而發揮腎臟保護作用。多項研究表明,單味中藥和中藥復方均可拮抗 EMT,效果顯著。現總結如下。

3.1 單味中藥及其有效成分抗 EMT 的研究 目前,單味中藥防治EMT的研究主要集中在單味中藥及其有效成分,如黃芪、丹參、三七和大黃等,均具有較好的療效。

3.1.1 黃芪 研究[14-15]發現,蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)/糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)信號途徑在RIF的發病中起重要作用。當PKB磷酸化激活后,可磷酸化下游分子的 GSK-3β,使之失活,從而抑制了 GSK-3β降解β-連環蛋白(β-catenin)的作用,導致胞質內β-catenin 含量增加,更多的β-catenin 移至細胞核,與來自淋巴增強因子 1(lympoid enhancer factor 1, LEF1)/T細胞因子(T cell factor, TCF)家族轉錄因子結合,從而啟動下游靶基因(EMT關鍵分子)的轉錄,加劇 EMT 的進程。黃芪是常用的補氣藥,對腎臟具有保護作用[16]。黃芪中的有效成分黃芪甲苷可通過逆轉 PKB/GSK-3β信號途徑,抑制 EMT 的發生、發展,發揮保護腎臟的作用[17]。HU等[18]的研究發現,趨化因子 CX3C 的配體1(chemokine CX3C ligand 1, CX3CL1)可使加速纖維肉瘤蛋白(rapidly accelerate fibrosarcoma protein, Raf)磷酸化并激活,激活狀態下的Raf進一步通過其位于 C 端的 CR3 結構域作用于下游絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase, MEK)的絲氨酸位點,使其磷酸化并激活,活化的MEK可使細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)的酪氨酸和蘇氨酸殘基發生磷酸化并活化,活化的ERK進入細胞核,激活EMT相關轉錄因子,如鋅指轉錄因子(snail family zinc finger 1, Snail 1)家族等,這些轉錄因子被激活后促進E-cad的降解,從而誘導 EMT 的發生、發展。黃芪甲苷可通過抑制 CX3CL1 的表達,進而抑制Raf/MEK/ERK信號通路的激活,改善高糖誘導的 HK-2 細胞 EMT 的發生、發展。

3.1.2 丹參 丹參是常用活血化瘀的中藥,近年來,許多研究[19]表明丹參可用于RIF的防治。丹參中的丹參酮 ⅡA 和丹酚酸 B 均有阻斷 EMT、抑制 RIF 的作用。Wnt 是一種分泌型糖蛋白,與跨膜受體 Frzzled 結合,激活胞質內的散亂蛋白(dishevelled, Dsh),抑制β-catenin 降解。β-catenin 作為經典 Wnt 信號通路的關鍵因子,在 EMT 的發生、發展中起重要作用。研究[20]發現,維生素 D 受體(vitamin D receptor, VDR)可與轉錄因子 TCF-4 競爭結合β-catenin,抑制 TCF-4 的轉錄活性,阻斷其啟動 EMT 下游靶基因的轉錄,減弱 EMT 的發生。丹參酮 ⅡA 可通過上調高糖誘導的 HK-2 細胞中 VDR 的表達,抑制 Wnt/β-catenin 信號通路,減弱 EMT 發生。自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和生物大分子物質,維持細胞內環境穩定的基本生命現象。在腎臟近端小管上皮細胞中,自噬的激活有利于維持上皮細胞的穩態,當自噬受到抑制后將導致變性蛋白質和失能細胞器等清除延遲及異常蓄積,誘發EMT[21]。沉默信息調節因子(solent information regulator, SIRT1)是近來發現的一類依賴 NAD+的第 Ⅲ 類組蛋白去乙酰化酶,其可通過一系列轉錄因子的去乙酰化來促進或增強自噬機制組成分子的表達,從而提高自噬水平,在細胞自噬中發揮重要作用。HE等[22]通過單側腎切除術制備大鼠RIF模型,發現丹酚酸 B 可改善腎功能,還可降低 EMT 相關蛋白的表達,激活 SIRT1 介導的自噬。當抑制自噬的激活和給予 SIRT1 抑制劑均可阻斷丹酚酸 B 對 EMT 的抑制作用,提示丹酚酸B可通過激活 SIRT1/自噬通路來減弱 EMT,進而改善 RIF。

3.1.3 三七 三七是常用的止血中藥,具有抗炎、抗氧化等藥理作用。三七亦可通過減弱EMT,進而發揮保護腎臟的作用。目前的研究認為,轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1, TGF-β1) 是轉分化最重要的調控因子之一,TGF-β1 與其受體結合可使下游的母親 DDP 同源物 3 (mothers against decapentaplegichomolog 3, Smad 3)發生絲氨酸磷酸化后激活,在細胞質中與 Smad 3 形成三聚體復合物,移至核內調控纖維化相關靶基因的轉錄,TGF-β1/Smad 信號通路在介導EMT的過程中扮演了重要角色。潘晶[23]的研究發現,三七皂苷可抑制大鼠RTECs的EMT過程,通過給予 SIRT1 激動劑白藜蘆醇和SIRT1抑制劑 EX527,結果表明三七皂苷可通過激活 SIRT1,使 Smad 3 去乙酰化,抑制 Smad 3 的轉錄活性,進而抑制 TGF-β1/Smad 通路,減輕 EMT 的發生。HUANG等[24]的研究發現,新型的三七多糖 SQD4S2 可明顯下調 HK-2 細胞中α-SMA、纖連蛋白1(fibronectin 1, FN1)和Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ alpha 1, Col1A1)和Ⅲ型膠原蛋白(collagen type Ⅲ alpha 1, Col3A1)等關鍵纖維化相關分子的表達,促進細胞正常功能的恢復,從而抑制 EMT 的發生,發揮抗 RIF 的作用。

3.1.4 大黃 大黃素是大黃的主要活性成分,具有抗 RIF 的作用。SONG等[25]的研究發現,TGF-β1可以抑制人肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A(carnitine palmitoytransferase 1A, Cpt1a)的活性,導致ATP消耗和脂質沉積,對RTECs EMT過程至關重要。大黃素可增加 TGF-β1 誘導的RTECs中 SIRT1 的表達,調控信號轉導和轉錄激活因子 3 (Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的去乙酰化,降低其磷酸化水平,抑制轉錄活性,致 STAT3 不能與 Twist 相關蛋白1(Twist related protein 1, Twist 1)基因啟動子近端的結合位點相結合,從而抑制Twist 1的轉錄活性,減弱 Twist 1對 Cpt1a 的負調節作用,上調 Cpt1a 的表達,以促進 Cpt1a 介導的脂肪酸氧化,進而抑制 EMT 過程。骨形態發生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)是重要的抗RIF因子,可維持RTECs的表型,直接影響RTECs的成纖維能力,作為TGF-β1超家族的一員,BMP-7 可通過影響 Smads 蛋白在細胞內信號的傳遞而抑制 TGF-β1 促進 Bim 蛋白表達的作用,從而抑制該蛋白與自噬誘導關鍵因子的結合[26-28]。LIU等[29]通過單側腎切除術建立阿霉素誘導的 RIF 大鼠模型和 TGF-β1 刺激的 HK-2 細胞模型,結果表明,大黃素干預后可明顯上調 BMP-7 的表達,從而上調自噬關鍵因子微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)、酵母自噬相關基因6同源物(becn1 gene, Beclin1)的表達,激活細胞自噬,抑制 EMT 的發生,延緩 RIF,起到保護腎臟的作用。

3.1.5 其他 體內外實驗研究[30]表明,姜黃素可改善 UUO 小鼠的腎臟病理損傷,抑制 HK-2細胞 EMT 的發生和炎癥反應,其可通過抑制 Toll 樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/PKB 信號通路,抑制EMT和炎癥反應,改善RIF。XIAO等[31]的研究發現,氧化苦參堿可抑制db/db糖尿病小鼠腎組織 EMT 的發生,亦可逆轉高糖誘導大鼠RTECs的 EMT 過程,并減少 ECM 的分泌,其具體機制為分化抑制因子2 (inhibitor of differentiation 2, Id2) 與 Twist 形成二聚體,抑制Twist 對下游因子 E-cad 的轉錄調控作用,延緩 EMT 的進程。氧化苦參堿可阻斷高糖對 Id2 的抑制作用,通過 Id2/Twist 途徑拮抗EMT,減少RTECs損傷。研究[32]發現,lncRNA 可結合 miRNA,影響 miRNA 的表達,間接調控 mRNA 的表達。CAI等[33]的研究發現,黃連可通過抑制 lncRNA CLYBL-AS2 的表達,阻斷其與 miR 204-5p的結合,使 miR 204-5p 的表達上調,抑制 Snai1 的表達,改善高糖誘導的 HK-2 細胞的 EMT 進展。

3.2 中藥復方的抗 EMT 研究 中藥復方在防治 EMT 的研究較多,主要包括腎復康、六味地黃湯、四妙散、益腎化瘀方、扶正化瘀方和當歸芍藥散等。

3.2.1 腎復康 腎復康可抗RIF,具有延緩腎功能惡化的作用[34]。整合素連接激酶(integrin-linked kinase, ILK)與整合素胞質結構域相互作用,將細胞內骨架蛋白與ECM連接并傳遞重要生物信號。ILK 作為 TGF-β/Smad 信號通路的重要下游效應因子,可調控E-cad和ECM(Col-Ⅰ、FN)的釋放,是 EMT 過程中的重要調節因子。黃上等[35]發現,腎復康含藥血清能減弱 Smad 2/3 的活性,抑制 p-Smad 2/3 入核,使 ILK 表達減少,從而抑制 EMT 關鍵分子的表達,改善細胞形態,減少ECM的沉積,緩解 HK-2 細胞的 EMT 進程,有助于減輕 RIF。

3.2.2 六味地黃湯 六味地黃湯具有滋陰補腎的功效,是常用的經典名方,廣泛應用于腎臟疾病的治療。在低氧的情況下,缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)可激活下游因子 Twist,使 Twist 與 E-cad 啟動子結合并募集共抑制因子來抑制 E-cad 的轉錄,參與 EMT 的調控。董翔[36]通過5/6腎切除法構建 RIF 模型,發現六味地黃湯可有效防治慢性腎臟疾病,其作用與改善腎內缺氧、下調 HIF-1α 和 Twist 的表達、上調 E-cad 的表達、延緩 EMT和減輕 RIF 有關。

3.2.3 四妙散 康潔等[37]采用尿酸誘導HK-2轉分化,四妙散干預后可下調結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表達、上調 BMP-7 的表達來維持RTECs表型,逆轉EMT,發揮保護腎臟作用。

3.2.4 益腎化瘀方 臨床實踐證明,益腎化瘀方在治療腎病方面具有較好的療效。實驗研究[38]發現,益腎化瘀方可改善EMT后的細胞形態,上調 BMP-7 的表達,進而拮抗 TGF-β1 的致纖維化效應,逆轉 EMT,緩解 RIF 的進程。γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)是重要的抗RIF因子,其與細胞表面特異性受體結合后,激活 Janus 激酶(Januskinase 1),致 STAT1 發生磷酸化并形成同源二聚體 GAF,進入細胞核內,與 IFN-γ 活化序列反應元件結合,啟動 Smad 7 的轉錄和表達。Smad 7 通過招募 E3 泛素連接酶到 TGF-β1受體,致其泛素化降解,抑制受體對 Smad 2/3 的磷酸化,從而阻斷 TGF-β1 的信號通路,逆轉 EMT 的發生[39]。李立等[40]通過對血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)刺激 HK-2 細胞 EMT 模型證實,益腎化瘀方可通過上調 IFN-γ 的表達,下調 TGF-β1 的表達,進一步抑制 Col-Ⅰ、Col-Ⅳ 的生成,延緩 EMT 的發生。

3.2.5 其他 UUO 大鼠腎組織中 TGF-β1 表達增加,可誘導其下游因子 ILK 的過表達,致 PKB 和 GSK-3β發生磷酸化,GSK-3β的磷酸化使β-catenin 核易位并活化轉錄因子激活蛋白1(activator protein-1, AP-1),活化的 AP-1 與基質金屬蛋白酶-9 的啟動子結合,上調基質金屬蛋白酶-9的表達,從而降解基底膜的主要支架 Col-Ⅳ,使腎小管基底膜破壞,增強了細胞遷移侵襲,為EMT的細胞最終移行到腎間質起重要作用。扶正化瘀方干預后可明顯下調 p-GSK-3β、p-PKB和β-catenin 的表達,減弱 AP-1 的轉錄活性,以延緩 EMT[41]。激活 Notch 信號通路可通過轉錄調控 EMT 相關信號分子來激活 EMT,在誘導和調節 EMT 中起著關鍵作用。研究[42]發現,當歸芍藥散含藥血清可明顯降低高糖誘導的 HK-2 細胞中 Notch 信號通路相關分子 Notch 胞內區域(Notch intrecellular domain, NICD)、發狀分裂相關增強子5(hairy and enhancer of split 5, Hes5)、Notch 受體(Notch1)和 Notch 配體(Jagged-1)的表達,進而下調α-SMA 的表達,上調 E-cad 的表達,以抑制 EMT,保護受損細胞。WANG等[43]的體內外研究表明,扶正化瘀方能減輕 HgCl2誘導的 RIF 大鼠的病理損傷,其具體機制通過降低 miR-21 的表達,減弱其抑制靶基因磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)的轉錄作用,使 PTEN 的表達上調,發揮其脂質磷酸酶的活性,抑制 PKB 向質膜轉移,進而抑制 PKB 的磷酸化,從而抑制 EMT 和減少 ECM 的沉積,延緩 RIF 的發展。

4 小 結

EMT 的發生是 RIF 發展過程的核心環節。因此合理調節 EMT 是保護腎功能的有效策略。在治療腎臟疾病的機制研究中,中藥可調控 EMT 延緩 RIF,且表現出其獨有的優勢和特色。EMT 的發生、發展受到多因素、多種機制的調控,是一個復雜的過程。本研究闡述了部分中藥和中藥復方抑制 EMT 的研究,但中藥可以通過在多個環節、多個靶點發揮抗 RIF 的作用。目前,中藥抑制 EMT 的研究,主要還是聚焦于動物試驗和細胞實驗,今后可在中醫藥理論的指導下,借助現代醫學研究成果,將中藥抑制 EMT 的機制和作用環節進行深入的研究,有助于開發具有抗 EMT 作用的新型藥物及新的治療途徑。