聚酮合酶基因島在肺炎克雷伯菌臨床分離株中的流行研究

陳艷淑, 羅陳爍, 楊濱

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是臨床常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病菌,易引起嚴(yán)重感染[1]。當(dāng)前高毒力和高耐藥性的肺炎克雷伯菌均在世界范圍內(nèi)流行。不同于普通肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae,cKP),高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae,hvKP)更易導(dǎo)致社區(qū)獲得性感染,引起肝膿腫、肺炎、腦膜炎等疾病[2-4]。近年來(lái),以耐碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)為主的高耐藥性菌株比例也逐年上升[5],這些變化給臨床治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。而聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因島是編碼腸桿菌目毒素因子的重要基因,并與細(xì)菌的其他毒力因子存在聯(lián)系性[6]。PKS基因島編碼合成的基因毒素能夠誘導(dǎo)真核細(xì)胞 DNA 損傷斷裂[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn),感染PKS+肺炎克雷伯菌加劇患者淋巴細(xì)胞減少,并顯著增加患者的死亡率[9],同時(shí)在小鼠腦膜炎的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮毒性作用[10]。因此,PKS基因島與感染患者的病情進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)。目前關(guān)于PKS基因島在肺炎克雷伯菌中的研究主要集中在血流感染方面,對(duì)于PKS基因島臨床分布情況的分析相對(duì)較少。本研究收集臨床分離的肺炎克雷伯菌株,分析PKS基因島的臨床分布特征,探討PKS基因島對(duì)患者感染情況的影響,為臨床肺炎克雷伯菌感染的診療提供有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(筆者醫(yī)院)2019—2021 年病原菌感染患者送檢的 234 株非重復(fù)肺炎克雷伯菌作為實(shí)驗(yàn)菌株。根據(jù)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)鑒定結(jié)果判定為肺炎克雷伯菌,將其保存至細(xì)菌庫(kù)。查詢并記錄感染者的臨床資料。本研究獲得筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào):MTCA,ECFAH of FMU 〔2015〕 084-2)。

1.2 試劑與儀器 PCR 引物(福州尚亞生物技術(shù)有限公司);2×Taq PCR Master Mix(福州艾科瑞生物技術(shù)有限公司);4S GelRed 核酸染料[生工生物工程(上海)股份有限公司];DL2000 DNA Marker(福州艾科瑞生物技術(shù)有限公司);全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)布魯克公司);全自動(dòng)凝膠圖像系統(tǒng)(Tanon-1600R,上海天能科技有限公司);PCR 擴(kuò)增儀[VeritiTM DX96well thermal,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司];數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(EPS-300,上海天能科技有限公司);全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)(Vitek-2 compact system,美國(guó)梅里埃公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌落篩選、鑒定與保存 挑取臨床標(biāo)本中的疑似肺炎克雷伯菌單菌落,通過(guò)MALDI-TOF MS 進(jìn)行鑒定(分析范圍 0～15 000m/z),根據(jù)飛行質(zhì)譜標(biāo)志峰的特點(diǎn),將飛行質(zhì)譜鑒定分值>2.0 的菌株判定為肺炎克雷伯菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。再采用分區(qū)劃線法涂布于培養(yǎng)基,置于 37 ℃ 恒溫箱過(guò)夜。將純菌落保存在凍存管中,蓋上蓋子密封,并注明患者的姓名、細(xì)菌名稱和保存日期后保存于-80 ℃ 冰箱。

1.3.2PKS基因檢測(cè) 熱裂解法提取 DNA,采用 PCR 篩查所有菌株的PKS基因。根據(jù)PKS基因的相關(guān)研究[11],其 4 個(gè)區(qū)域(clbA、clbB、clbN和clbQ)檢測(cè)陽(yáng)性認(rèn)為PKS基因存在,引物序列參考文獻(xiàn) [12],具體信息見(jiàn)表 1。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃ 預(yù)變性 5 min→95 ℃ 變性 30 s→53 ℃ 退火 30 s→72 ℃ 延伸 1 min,進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán),最后 72 ℃ 延伸 10 min。擴(kuò)增后的 PCR 產(chǎn)物加入 2% 瓊脂糖凝膠板。電泳參數(shù):100 mA,180 V,40 min。電泳后進(jìn)行凝膠成像檢測(cè)。將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并比對(duì)分析。

1.3.3 資料收集 追蹤 234 例肺炎克雷伯菌感染患者的病例資料,根據(jù)有、無(wú)PKS基因島分為PKS+組和PKS-組。記錄患者的病史,包括患者的基本資料(性別、年齡和科室)、實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)、感染部位和出院診斷等。

1.3.4 MALDI-TOF MS 篩選與藥敏實(shí)驗(yàn) 采用 MALDI-TOF MS 鑒定PKS+菌株和PKS-菌株標(biāo)志峰是否存在差別,使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行臨床常見(jiàn)抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果根據(jù) 2019 年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類變量采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。連續(xù)變量呈非正態(tài)分布,采用 Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)分析差別。P<0.05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR 驗(yàn)證 根據(jù)PKS基因的相關(guān)研究[11],PKS基因 4 個(gè)區(qū)域(clbA、clbB、clbN和clbQ)檢測(cè)陽(yáng)性為PKS基因陽(yáng)性(圖 1)。

PKS:聚酮合酶。M:GLred DNA Marker。A:PKS基因島瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果;B:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測(cè)序結(jié)果;C:部分菌株P(guān)KS 基因島瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

2.2 MALDI-TOF MS 鑒定結(jié)果 采用現(xiàn)有 MALDI-TOF MS 方法分析PKS+菌株和PKS-菌株的質(zhì)譜特征峰,并疊加兩者的飛行質(zhì)譜結(jié)果(分析范圍為 0～15 000m/z),可見(jiàn)二者的主要標(biāo)志峰近似(圖 2)。比較PKS基因表達(dá)的質(zhì)譜圖特征峰,二者并無(wú)差別。

PKS:聚酮合酶。MALDI-TOF MS:基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜。

2.3 菌株來(lái)源樣本類型分布 本研究按照 MALDI-TOF MS 判定標(biāo)準(zhǔn)共納入菌株 234 株。菌株來(lái)源樣本類型包括痰液、血液、尿液、膿液、腹水和膽汁等 15 類,主要來(lái)源于痰液(70.1%,164/234)、血液(7.3%,17/234)、腹水/膽汁(5.6%,13/234)和膿液(4.3%,10/234)。

2.4PKS基因島臨床特征分布情況PKS+組與PKS-組感染者的性別、年齡構(gòu)成上比較,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PKS+組感染者中,來(lái)源于肝病中心(18.2%,16/88)較PKS-組感染者(6.2%,9/146)多(P=0.004),患有肝膿腫的比例(13.6%,12/88)較PKS-組感染者(1.4%,2/146)高(P<0.001)。其余結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 PKS 基因島臨床特征分布表

2.5PKS+肺炎克雷伯菌耐藥情況 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),PKS+菌株的耐藥性較PKS-菌株低。PKS+菌株在氨曲南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明的抗菌藥物敏感性更高(P<0.001,表3)。

表3 PKS 基因島耐藥情況表

3 討 論

PKS基因島為 54 kb 基因組成,主要編碼合成PKS和非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)。該基因島是腸桿菌目的重要基因,與多種細(xì)菌毒力因子相關(guān)[6]。含有PKS基因島的菌株可以合成一種基因毒素——Colibactin。Colibactin 通過(guò)誘導(dǎo)真核細(xì)胞 DNA 雙鏈斷裂,染色體畸變,并使細(xì)胞周期停滯在 G2/M 期,以此發(fā)揮其毒性作用,并在細(xì)菌感染中具有重要價(jià)值[13-14]。攜帶有PKS基因島菌株更易在新生兒尚未完全成熟的腸道中定植,隨后通過(guò)血流轉(zhuǎn)移至其他部位[15]。此外,PKS+肺炎克雷伯菌株感染小鼠后,對(duì)其大腦具有趨向性,在小鼠腦膜炎進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮毒性作用[10]。目前關(guān)于PKS基因島的研究主要在血流感染方面,對(duì)于肺炎克雷伯菌中對(duì)于PKS基因島的研究還尚有不足。

在既往研究[11,13,16-17]中,肺炎克雷伯菌的PKS基因島攜帶率為 3.5%～26.8%。本研究發(fā)現(xiàn),PKS+菌株占臨床分離株的 37.6%(88/234)。本研究結(jié)果較文獻(xiàn)報(bào)道[11,13,16-17]的PKS+肺炎克雷伯菌的流行率更高,提示近年來(lái)的PKS基因島在肺炎克雷伯菌表達(dá)具有流行趨勢(shì)?？紤]到PKS基因島的細(xì)胞毒性作用,這種變化趨勢(shì)應(yīng)當(dāng)引起高度重視,預(yù)防高毒力菌株在臨床流行。

本研究發(fā)現(xiàn),感染PKS+肺炎克雷伯菌的患者更易發(fā)生肝膿腫(P<0.001),而患者肝臟感染 hvKP 后更易形成膿腫并引起各種并發(fā)癥[18-19],這意味著PKS基因島在 hvKP 感染者肝膿腫形成中發(fā)揮重要作用。統(tǒng)計(jì)分析抗菌藥物的敏感性發(fā)現(xiàn),PKS+肺炎克雷伯菌的耐藥性低。結(jié)合 hvKP 的相關(guān)研究[20]可知,肺炎克雷伯菌高毒力的存在通常伴隨著藥物敏感性的降低,因此,上述結(jié)果可能是由于PKS+肺炎克雷伯菌存在高毒力情況,但需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn),高毒力菌株對(duì)于藥物也出現(xiàn)耐藥性,這提示菌株可能也存在耐藥基因。肺炎克雷伯菌中毒力和耐藥性的結(jié)合將是臨床抗感染治療的一個(gè)更大挑戰(zhàn)。此外,對(duì) MALDI-TOF MS 鑒定結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),不存在特殊的質(zhì)譜標(biāo)志峰快速鑒定PKS+肺炎克雷伯菌,這說(shuō)明現(xiàn)有的微生物鑒定方式尚無(wú)法對(duì)PKS+肺炎克雷伯菌進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。因此,亟需探討PKS基因島的快速鑒定,進(jìn)而針對(duì)肺炎克雷伯菌患者進(jìn)行精準(zhǔn)有效的治療。

綜上所述,PKS基因島在肺炎克雷伯菌菌株的檢出率具有日益增長(zhǎng)的趨勢(shì),且更易導(dǎo)致肝膿腫的發(fā)生。PKS+肺炎克雷伯菌攜帶更多的毒力基因,并表現(xiàn)出相對(duì)較低的抗菌藥物敏感性。應(yīng)對(duì)PKS基因島在肺炎克雷伯菌的流行情況引起高度重視,建議開(kāi)展更廣泛的監(jiān)測(cè),為臨床治療和預(yù)防其傳播提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。