短鏈脂肪酸通過激活GPR43上調AMPK信號通路抑制小鼠胰島β細胞凋亡*

張春雪,王晨菲,靳 瑾△

新疆醫科大學第五附屬醫院:1.體檢與健康管理科;2.內分泌科,新疆烏魯木齊 830000

據報道,糖尿病是全球范圍內10大疾病相關死亡原因之一,2019年約有400萬20～79歲的人死于糖尿病[1]。研究發現,胰島β細胞凋亡進而導致胰島的功能損害是1型糖尿病(T1D)發病的原因之一[2]。目前針對T1D及其并發癥尚無理想的治療方法[3],因此尋找更好的生物治療靶點來控制T1D至關重要。

腸道微生物能夠發酵難以消化的食物,如膳食纖維等,最終產生短鏈脂肪酸[4],短鏈脂肪酸是指低于6個碳原子的脂肪酸鹽,如醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等[5]。研究表明,僅口服和膳食補充丁酸鹽可以預防高脂肪飲食引起的肥胖和胰島素抵抗[6],MOON等[7]研究發現,短鏈脂肪酸水平降低與T1D患者風險增加相關。同時有研究表明,增加短鏈脂肪酸的攝取可以緩解1型糖尿病患者的癥狀[8]。G蛋白偶聯受體43(GPR43)是一種G蛋白偶聯受體,主要在免疫細胞、腸內分泌細胞和脂肪細胞中表達,可識別短鏈脂肪酸[9]。胰島β細胞凋亡是T1D的關鍵致病因素,PINGITORE等[10]研究發現,短鏈脂肪酸在體外刺激胰島素分泌并減少小鼠和人類胰島細胞凋亡。目前,短鏈脂肪酸抑制胰島β細胞凋亡的分子機制仍缺乏進一步的研究。本研究通過對TID小鼠口服灌胃乙酸鈉和丙酸鈉治療,探究短鏈脂肪酸對小鼠胰島β細胞的調節作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料來源 40只SPF級雄性C57BL/6J小鼠(6～8周齡,20～25 g)購自新疆醫科大學實驗動物中心,生產許可證號為SCXK(新)2018-0002。所有小鼠于室溫25 ℃,自然光暗周期的環境中飼養,實驗期間自由飲食、飲水。

1.2細胞與主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國SigmaAldrich公司,乙酸鈉、丙酸鈉購自上海譜振生物有限公司,胰島素ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司,膠原酶Ⅴ購自北京沃卡威生物技術有限公司,Ficoll分離液、Hanks平衡鹽溶液購自上海士鋒生物科技有限公司,min6細胞購于上海谷研生物科技有限公司,RPMI 1640培養基、胎牛血清、胰酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。si-NC、si-GPR43、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,TRIzol、逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑購自上海翌圣公司,GPR43抗體、AMPK抗體、p-AMPK抗體、bcl-2抗體、caspase3抗體購自英國abcam公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體購自廣州碩譜生物科技有限公司,RIPA組織細胞快速裂解液購自北京索萊寶科技有限公司,ECL試劑盒購自美國Millipore公司,Annexin V FITC試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。GPR43、bcl-2、caspase3的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3實驗方法

1.3.1動物造模、分組與給藥 將40只C57BL/6J小鼠隨機分為4組:正常組、模型組、乙酸鈉治療組、丙酸鈉治療組,每組10只。其中模型組、乙酸鈉治療組、丙酸鈉治療組小鼠混于一起造模,給予一次性腹腔注射 STZ(120 mg/kg),于1周后小鼠尾靜脈取血糖,空腹血糖>13.8 mmol/L,則確認模型成功,隨后再隨機將這些小鼠分為模型組、乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組。乙酸鈉治療組、丙酸鈉治療組分別每日灌胃乙酸鈉(2 000 mg/kg)和丙酸鈉(2 000 mg/kg),正常組、模型組灌胃同等劑量生理鹽水。4組小鼠均每日灌胃給藥,1周后檢測各組小鼠體重和血糖水平。

1.3.2葡萄糖耐量試驗 于干預1周后,將小鼠禁食8 h,取小鼠尾靜脈血,用微量血糖儀檢測空腹血糖,隨后給予0.04 mL/kg 50%葡萄糖溶液灌胃,于灌胃后0.0、0.5、1.0、2.0 h取尾靜脈血,檢測血糖水平,并計算血糖曲線下面積(AUC)。

1.3.3血清胰島素水平檢測 將小鼠眼眶取血,離心,取上清液,按照酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書,用多功能酶標儀檢測吸光度,計算血清胰島素水平。

1.3.4胰島的提取 麻醉后脫頸處死小鼠,打開腹腔,暴露術野。用絲線結扎膽總管匯入十二指腸處后,用膠原酶Ⅴ(1 mg/mL)2～3 mL充分灌注小鼠胰腺,37 ℃恒溫靜置消化15 min。然后,用含10%FBS的預冷Hanks平衡鹽溶液終止消化。使用Ficoll密度梯度離心法純化小鼠胰島(密度1.108、1.096、1.069和1.037 g/mL)。

1.3.5細胞培養 min6細胞采用含10% FBS的RPMI 1640培養基培養,在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱培養。細胞達80%匯合時,胰酶消化細胞,顯微鏡下觀察大部分細胞變圓時終止消化,加入新鮮培養基,每隔兩天更換一次新鮮的培養基。待細胞生長密度達到80%時進行消化和傳代,取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.6細胞轉染和分組 將min6細胞分為si-NC組(轉染si-NC)、si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組(轉染si-NC,添加乙酸鈉和丙酸鈉)、si-GPR43組(轉染si-GPR43)、si-GPR43+乙酸鈉和丙酸鈉組(轉染si-GPR43,添加乙酸鈉和丙酸鈉)。按照Lipofectamine 2000說明書步驟進行轉染。調整min6細胞數量并接種于6孔板,使用不含抗菌藥物的完全培養基培養,使轉染時細胞達70%左右生長密度。制備si-GPR43特異性si-RNA(si-GPR43)與脂質體復合物,同時制備si-RNA(si-NC)與脂質體復合物,將復合物加入6孔板相應孔內。乙酸鈉和丙酸鈉組的終濃度均為100 μmol/L。

1.3.7RT-qPCR檢測GPR43、Bcl-2、caspase3表達水平 TRIzol試劑提取各組胰島組織和各組min6細胞中的總RNA,酶標儀檢測總RNA的純度和含量。RT-qPCR反應體系:cDNA模板2 ng,上、下游引物各0.4 μL,SYBR Primix Ex TaqTM5 μL,ddH2O補充至10 μL。PCR反應條件:95 ℃ 30 s預變性后,變性95 ℃ 7 s,退火55 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,共40個循環。擴增結果根據2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。PCR引物序列:GAPDH-F為5′-CCCTTAAGAGGGATGCTGCC-3′,GAPDH-R為5′-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3′;GPR43-F為5′-AATCAGAAGACAGAAAAGGAGCTG-3′,GPR43-R為5′-TCTGGGGTCATTCTCCTTGG-3′;Bcl-2-F為5′-AGCATGCGACCTCTGTTTGA-3′,Bcl-2-R為5′-GCCACACGTTTCTTGGCAAT-3′;caspase3-F為5′-GAGCTTGGAACGGTACGCTA-3′,caspase3-R為5′-CCGTACCAGAGCGAGATGAC-3′。

1.3.8Western blotting檢測GPR43、AMPK、p-AMPK、Bcl-2、caspase3表達水平 收集各組胰島組織和各組min6細胞,使用RIPA裂解提取總蛋白。樣品變性后通過SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶4 ℃封閉1 h,TBST洗膜5 min,3次,加入GPR43抗體(1∶1 000)、AMPK抗體(1∶1 000)、p-AMPK抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶1 000)、caspase3(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜5 min,3次,加入HRP標記的羊抗兔的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h,TBST洗膜5次,每次5 min。顯影曝光,利用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.3.9流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況 根據試劑盒檢測說明,收集4組min6細胞,采用細胞計數板計算細胞數目,選取3×105個重懸的細胞,離心棄上清,PBS洗滌1次,加入500 μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞。細胞懸液中加入5 μL的Annexin-V-FITC和5 μL PI染色液。輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育20 min,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結 果

2.1短鏈脂肪酸改善小鼠T1D疾病癥狀 結果顯示,與正常組比較,模型組小鼠體重降低,空腹血糖濃度升高,且高于13.8 mmol/L,口服葡萄糖耐量減弱,胰島素水平降低(P<0.05),說明STZ造模成功。與模型組比較,乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組小鼠體重升高,空腹血糖濃度降低,口服葡萄糖耐量增加,胰島素水平升高(P<0.05),見圖1。

注:A為體重比較;B為空腹血糖比較;C為口服葡萄糖耐量比較;D為血清胰島素比較;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

2.2短鏈脂肪酸激活小鼠胰島GPR43及AMPK信號通路 RT-qPCR結果顯示,與正常組比較,模型組小鼠胰島GPR43 mRNA表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組小鼠胰島GPR43 mRNA表達水平升高(P<0.05),見圖2。Western blotting結果顯示,與正常組比較,模型組小鼠胰島GPR43、p-AMPK蛋白表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組小鼠胰島GPR43、p-AMPK蛋白表達水平升高(P<0.05),見圖3。

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

圖3 短鏈脂肪酸促進胰島GPR43和p-AMPK蛋白表達

2.3短鏈脂肪酸抑制小鼠胰島細胞凋亡 RT-qPCR和Western blotting結果顯示,與正常組比較,模型組小鼠胰島caspase3 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05),bcl-2 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較,乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組小鼠胰島caspase3 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05),bcl-2 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05),見圖4、5。

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

圖5 短鏈脂肪酸對凋亡相關蛋白表達的影響

2.4沉默GPR43抑制AMPK信號通路 RT-qPCR結果顯示,與si-NC組比較,si-GPR43組GPR43 mRNA表達水平降低(P<0.05),見圖6A。Western blotting結果顯示,與si-NC組比較,si-GPR43組GPR43和p-AMPK蛋白表達水平降低(P<0.05),見圖6B。

注:A為RT-qPCR檢測GPR43基因表達;與si-NC組比較,*P<0.05;B為Western blotting檢測GPR43、p-AMPK蛋白表達。

2.5短鏈脂肪酸通過GPR43抑制min6細胞凋亡 RT-qPCR和Western blotting結果顯示,與si-NC組比較,si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組caspase3 mRNA和蛋白表達水平降低,bcl-2表達水平升高(P<0.05)。與si-NC組、si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組相比,si-GPR43組、si-GPR43+乙酸鈉和丙酸鈉組caspase3 mRNA和蛋白表達水平升高,bcl-2 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖7、8。流式細胞術結果顯示,與si-NC組比較,si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組細胞凋亡率降低(P<0.05)。與si-NC組、si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組相比,si-GPR43組、si-GPR43+乙酸鈉和丙酸鈉組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖9。

注:與si-NC組比較,*P<0.05;與si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組比較,#P<0.05。

圖8 沉默GPR43拮抗短鏈脂肪酸對細胞凋亡相關蛋白的抑制作用

注:與si-NC組比較,*P<0.05;與si-NC+乙酸鈉和丙酸鈉組比較,#P<0.05。

3 討 論

一項流行病學研究表明,全球T1D發病率正以每年3%～4%的速度增加,尤其是在年幼的兒童中[11]。盡管胰島素輸送治療和血糖監測方法有所改進,但絕大多數T1D患者血糖并未達到理想的控制水平。

短鏈脂肪酸是將膳食纖維與腸道健康聯系起來的關鍵代謝物。短鏈脂肪酸在促進健康方面發揮著重要作用,MIYAMOTO等[12]發現短鏈脂肪酸可以調節血壓,有益于心血管系統。另外有研究發現,乙酸鹽通過分泌胰高血糖素樣肽1和肽YY等腸道激素對宿主能量和底物代謝產生有益影響,如增加能量消耗和脂肪氧化、調節體重和葡萄糖穩態等[13]。本研究通過腹腔注射STZ誘導小鼠T1D模型,然后給予乙酸鈉和丙酸鈉灌胃治療,結果發現乙酸鈉和丙酸鈉治療顯著升高了小鼠體重、口服葡萄糖耐量和胰島素水平,降低了空腹血糖濃度,表明短鏈脂肪酸口服治療可以改善小鼠T1D疾病癥狀。

一般來說,短鏈脂肪酸可通過多種不同的方式進入細胞發揮作用,第1種是被動擴散,第2種是通過載體介導的轉運,第3種是激活G蛋白偶聯細胞表面受體。GPR43作為G蛋白偶聯受體的一種,可以結合短鏈脂肪酸協助其進入細胞,根據吸收部位的不同,分散到骨骼肌、肝臟、脂肪組織等外周組織中發揮作用[14]。最近的研究發現,人體攝入的膳食纖維可能會通過短鏈脂肪酸介導的GPR43和GPR109A作用來預防糖尿病腎病[15]。另外有研究表明,短鏈脂肪酸介導的GPR43激活可以抑制脂肪細胞中的胰島素信號傳導,從而抑制脂肪組織中的脂肪堆積,并促進其他組織中的脂質和葡萄糖代謝水平[16]。在本研究中,乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組小鼠胰島GPR43 mRNA和蛋白表達水平升高,提示短鏈脂肪酸發揮作用可能是通過激活GPR43實現的。

T1D作為一種自身免疫性疾病,胰島β細胞的增殖與凋亡的相對比例失調可導致胰島β細胞自身抗原的產生,導致促炎細胞因子、趨化因子、活性氧中間體和其他促凋亡刺激物濃度增加,從而誘導胰島β細胞凋亡[17]。HU等[18]采用乙酸鹽和丁酸鹽兩種短鏈脂肪酸均能防止STZ誘導的min6細胞凋亡、活力降低、線粒體功能障礙,表明短鏈脂肪酸在維持胰島β細胞代謝和促進胰島β細胞在應激條件下的存活等方面發揮著重要作用。PINGITORE等[19]研究發現,結腸遞送丙酸鹽可以改善胰島β細胞的胰島素分泌,可通過抑制細胞凋亡來增強葡萄糖刺激的胰島素釋放和維持胰島β細胞的功能。AMPK在細胞內許多生理和病理過程的調節中發揮重要作用,也被認為是治療糖尿病和其他代謝疾病的重要靶點,AMPK是一種異源三聚體蛋白,由一個催化α亞基和兩個調節亞基β和γ組成[20]。研究表明,調節AMPK活性可以誘導或抑制細胞凋亡[21]。在本研究中,通過檢測凋亡相關蛋白caspase3和bcl-2的mRNA和蛋白表達,發現乙酸鈉治療組和丙酸鈉治療組小鼠胰島細胞凋亡率降低,p-AMPK蛋白表達水平升高,以上結果表明短鏈脂肪酸通過激活AMPK信號通路來抑制小鼠胰島細胞的凋亡。為了探究短鏈脂肪酸是否通過激活GPR43對AMPK信號通路的調節來發揮作用,本研究通過沉默GPR43抑制AMPK信號通路后,凋亡相關蛋白caspase3和bcl-2的mRNA和蛋白表達水平均升高,表明細胞的凋亡水平增加,而當使用乙酸鈉和丙酸鈉進行治療后抑制了細胞的凋亡。以上結果表明短鏈脂肪酸通過激活GPR43,從而上調AMPK信號通路來抑制胰島β細胞凋亡。

綜上所述,本研究結果發現,短鏈脂肪酸口服治療可以改善小鼠T1D疾病癥狀,短鏈脂肪酸可通過激活GPR43上調AMPK信號通路,從而抑制小鼠胰島β細胞凋亡,緩解T1D。以上結果初步明確了短鏈脂肪酸在T1D治療中的作用,提示增加短鏈脂肪酸的攝取可能是預防及治療T1D的一種有價值的策略,可能為探索糖尿病的治療提供新的思路。