瑞芬太尼在子宮內膜癌細胞增殖及遷移中的調節機制及對miR-212-3p/LIN28B通路的影響

劉 潔,梅軍華,張立成

(黃岡市中心醫院,湖北 黃岡 438000)

子宮內膜癌是發生在子宮內膜的一組上皮惡性腫瘤,主要是由于刺激素過度刺激子宮內膜引起,且肥胖、高血壓、月經初潮、不孕不育及卵巢疾病等均為該疾病高危因素[1-2]。Sugiura 等[3]研究表明:子宮內膜癌好發于絕經期及絕經后女性中,且70.0%～75.0%患者為絕經后女性,且隨著人們生活方式改變,導致疾病發生率呈上升趨勢,居婦科惡性腫瘤首位[4-5]。手術、放化療是子宮內膜癌患者常用的治療方法,但是患者5年生存率較低、預后較差[6]。瑞芬太尼屬于是阿片類藥物的一種,不僅能用于臨床麻醉,亦可通過抑制Akt通路、調控B細胞淋巴瘤(B cell lymphoma,Bcl)-2相關蛋白,可抑制細胞的增殖、促進其凋亡,但是藥物在子宮內膜癌中的作用效果研究較少。近年來,有報道[7]指出,多種微小RNA(microRNA,miRNA)能直接參與人類癌癥的發病過程,miRNA可作為癌基因和腫瘤因子發揮作用。miRNA是一類大約19～24個核苷酸構成的非編碼小RNA分子,通過靶向下游mRNA影響其轉錄或翻譯,從而調控基因的表達。已有文獻[8]報道,miR-212-3p參與各種腫瘤的發生和發展,且在胃癌、骨肉瘤等實體瘤中呈低表達,影響腫瘤細胞的遷移與侵襲,而LIN28B是其靶基因,在肝癌、宮頸癌等病灶組織中表達異常,能作為患者預后的生物指標[9]。本研究以子宮內膜癌Ishikawa細胞為研究對象,探討瑞芬太尼在子宮內膜癌細胞增殖及遷移中的調節機制及對miR-212-3p/LIN28B通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 子宮內膜癌Ishikawa細胞,購自于上海生化細胞研究所,并將其置于RPMI-1640培養基中,連續完成24 h培養,培養溫度37 ℃,將最終獲得的細胞放置在4個不同試管中,備用。Transwell小室,購自于美國Corning公司;Lipofcctaminc 2000購自于Invitrogcn公司;四甲基偶氮唑藍,購自于美國Sigma公司;引物序列、miR-212-3p模擬物及抑制劑、LIN28B小干擾RNA等,均購自于廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、處理及轉染:①細胞培養:取子宮內膜癌Ishikawa細胞,常規復蘇后,加入10% FBS的RPMI1640培養基中,并將其置于37 ℃、5% CO2培養箱中,待細胞融合80.0%～90.0%時,加入胰蛋白消化。常規制成細胞懸液后,進行細胞傳代培養。調整細胞濃度為2.5×104個/ml子宮內膜癌Ishikawa細胞,將其接種在6孔培養板中,連續完成24 h培養,備用[10]。②細胞處理:取子宮內膜癌Ishikawa細胞,隨機將其放置在4個試管中,分別給予瑞芬太尼5、50、500 ng/ml的培養基連續完成24 h培養備用[11],以瑞芬太尼0 ng/ml為對照組。③細胞轉染:取上述處理后的子宮內膜癌Ishikawa細胞,連續完成6 h轉染,轉染miR-NC、miR-212-3p mimics、si-NC及si-LIN28B,連續完成24 h干預,分別標記為:miR-NC組、si-NC組、si-LIN28B組;將轉染anti-miR-NC和aiti-miR-212-3p的細胞采用500 ng/ml瑞芬太尼處理,并記為瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組和瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-miR-212-3p組。采用實時熒光PCR法測定轉染細胞中miR-212-3p水平,驗證轉染效果,并完成細胞收集、備用。

1.2.2 增殖抑制率檢測:取各組處理后的子宮內膜癌Ishikawa細胞,將其接種在96孔板中,每孔細胞200 μl,連續完成12 h培養,并加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl,37 ℃下進行72 h培養。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,10 min孵育振蕩,于24、48、72 h采用酶標儀在490 nm下完成吸光度值測定[12]。

1.2.3 miR-212-3p、LIN28B mRNA水平測定:取各組處理后的細胞,采用Trizol試劑完成細胞總RNA的提取,借助微量核酸儀完成RNA濃度提純后,進行反轉錄,并進行PCR測定。借助實時熒光PCR法測定miR-212-3p、LIN28B mRNA水平,設定條件:95 ℃變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃下延伸30 s,連續完成循環45個,測定Ct值。以β-actin作為內參,采用2-△△Ct完成水平miR-212-3p、LIN28B mRNA測定[13]。

1.2.4 Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白測定:取上述細胞,完成總蛋白提取后,利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度,待上述操作完畢后,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將獲得的蛋白轉移于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,采用濃度為5%的脫脂牛奶常規下完成1 h封閉,4 ℃下加入細胞周期蛋白(Cyclin D1)、基質金屬蛋白酶(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及LIN28B蛋白一抗孵育,洗膜后加入二抗,1 h孵育后加入顯影劑,避光顯影,借助全能型成像分析系統拍照,分析目標蛋白含量[14]。

1.2.5 遷移及侵襲檢測:取上述處理后的子宮內膜癌Ishikawa細胞,將其接種在6孔板中,濃度為2.5×104個/ml,連續完成12 h培養后,去除培養基,整細胞濃度為1.0×105個/ml。①細胞遷移實驗:取處理后細胞10 μl,放于Transwell小室內,保證細胞懸液100 μl,并加入含有500 μl 10%FBS的培養基,連續完成24 h培養后去除培養基,采用4%多聚甲醛連續完成15 min固定,0.1%結晶紫染色后顯微鏡下觀察[15];②細胞侵襲實驗:測定前在Transwell小室鋪設基質膠,自然晾干后加入細胞懸液100 μl,其余操作同細胞遷移實驗[16]。

2 結 果

2.1 四組子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖抑制率比較 隨著時間延長子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖抑制率較為明顯,四組24 h細胞增殖率比較無統計學差異(均P>0.05);且細胞增殖抑制率呈瑞芬太尼藥物劑量依賴性(500 ng/ml瑞芬太尼細胞增殖抑制率最高)。見表1。

表1 四組子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖抑制率比較(%)

2.2 四組子宮內膜癌Ishikawa細胞miR-212-3p、LIN28B mRNA及相關蛋白表達比較 四組不同濃度瑞芬太尼處理后miR-212-3p mRNA表達水平呈上升趨勢(均P<0.05),而LIN28B mRNA水平呈下降趨勢(均P<0.05),并呈劑量依賴性;Western Blot結果表明:四組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白表達比較差異具有統計學意義(均P<0.05),隨著瑞芬太尼藥物劑量增加,其表達水平呈下降趨勢。見表2。

表2 四組子宮內膜癌Ishikawa細胞miR-212-3p、LIN28B mRNA及相關蛋白表達比較

2.3 四組子宮內膜癌Ishikawa細胞遷移及侵襲情況比較 隨著瑞芬太尼濃度增加,遷移細胞數與侵襲細胞數下降明顯,并表現出劑量依賴;不同濃度細胞遷移與侵襲細胞數比較差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3 四組子宮內膜癌Ishikawa細胞遷移及侵襲情況比較(個)

2.4 子宮內膜癌Ishikawa細胞轉染后細胞增殖、遷移及侵襲結果比較 miR-NC組細胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics(P<0.05),遷移細胞數、侵襲細胞數高于miR-212-3p mimics組(均P<0.05),見表4。

表4 子宮內膜癌Ishikawa細胞轉染后細胞增殖、遷移及侵襲結果比較

2.5 抑制LIN28B蛋白對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、遷移及侵襲的影響 抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B組細胞增殖抑制率高于si-NC組(P<0.05);遷移細胞數、侵襲細胞數及LIN28蛋白表達水平均低于si-NC組(均P<0.05),見表5。

表5 抑制LIN28B蛋白對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.6 抑制miR-212-3p對500 ng/ml瑞芬太尼處理后細胞活性的影響 瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-212-3p組miR-212-3p、細胞增殖抑制率低于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組(均P<0.05),LIN28B蛋白表達、遷移細胞數及侵襲細胞數高于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組(P<0.05),見表6。

表6 抑制miR-212-3p對500ng/ml瑞芬太尼處理后細胞活性的影響

3 討 論

子宮內膜癌屬于女性生殖系統常見的惡性腫瘤,具有較高的發病率、致死率,對女性生命健康造成極大的威脅。Smith 等[17]研究表明:子宮內膜癌病因較多,藥物、肥胖、生殖因素、糖尿病及飲食等,均會增加疾病發生率。目前,臨床上對于子宮內膜癌以子宮切除手術、雙側輸卵管卵巢切除術及盆腔淋巴結清掃術為主,借助手術雖然能切除病灶組織,但是遠處轉移或復發率較高。

阿片類藥物在晚期癌痛的治療中使用較多,而瑞芬太尼是芬太尼類μ型阿片受體激動劑,在人體內1 min左右可迅速達到血腦平衡,在組織和血液中可迅速被水解,具有起效速度快、維持時間短等優勢[18]。夏瑩等[19]研究表明:瑞芬太尼的鎮痛、不良反應呈劑量依賴性,對于μ型阿片受體激動作用能被納洛酮拮抗。同時,瑞芬太尼能通過抑制Akt通路及調控B細胞淋巴瘤(bcl)-2/Bcal-2相關蛋白表達,抑制腫瘤細胞的增殖,加快其凋亡速度。羅星等[20]研究表明:惡性腫瘤的發生與發展常伴有細胞增殖的失控,而Cyclin D1可通過調節、激活細胞周期依賴性酶完成細胞的增殖與分裂,參與子宮內膜癌的發生與發展。本研究中,四組不同濃度瑞芬太尼處理后miR-212-3p mRNA呈上升趨勢,而LIN28B mRNA水平呈下降趨勢;四組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白比較差異具有統計意義,從本研究結果看出,瑞芬太尼作用于子宮內膜癌細胞中,能通過調節Cyclin D1、MMP-2及LIN28B蛋白影響細胞的增殖與分化。

miR-212-3p屬于是一種miRNA,在骨肉瘤、胰腺癌、胃癌等細胞中呈低表達,與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等緊密相關,可作為潛在的治療靶點。生物學軟件預測結果表明:LIN28同源物可能是miR-212-3p的基因靶點。LIN28屬于高度保守的鋅指家族蛋白成員,在肝癌、胃癌及宮頸癌等實體瘤中表達升高,可作為患者預后的生物學指標。而子宮內膜癌細胞的遷移與侵襲亦是惡性腫瘤重要的特征之一,發病后常伴有miRNA基因表達異常,可參與細胞的增殖、凋亡及分化過程。本研究中,隨著瑞芬太尼濃度增加,遷移細胞數與侵襲細胞數呈下降趨勢,呈劑量依賴性;miR-NC組細胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics組;遷移細胞數、侵襲細胞數多于miR-212-3p mimics組;抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B細胞增殖抑制率高于si-NC組;遷移細胞數、侵襲細胞數及LIN28蛋白均低于si-NC組。從本研究結果看出,miR-212-3p在子宮內膜癌的發生、發展中發揮了重要的作用,能通過調控相關蛋白表達,調節細胞的增殖與遷移,miR-212-3p有望成為子宮內膜癌新的治療靶點,通過有效的方法提高患者體內miR-212-3p水平,能延緩病情發展,降低患者病死率。

綜上所述,瑞芬太尼能抑制子宮內膜癌細胞生物學活性,可能與藥物調控miR-212-3p/LIN28B通路有關。