微小RNA-195通過靶向抑制PH結構域富亮氨酸重復蛋白磷酸酶2表達參與香煙煙霧誘導急性肺損傷機制研究

梁艷均,吳桂全,漆 勇,李 靜

(川北醫學院附屬三臺醫院 三臺縣人民醫院,四川 三臺 621100)

隨著近些年我國環境污染的加重,各類呼吸系統疾病的發病率呈現逐年遞增趨勢,慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一類以氣流阻塞為典型癥狀的疾病,患者主要臨床表現為以氣流阻塞為特征的氣管炎癥和肺氣腫,如未得到及時干預可能會發展為肺心病或呼吸衰竭,COPD具有較高的致殘率和病死率,全球40歲以上發病率現已高達9%～10%[1-3]。研究[4]指出,COPD的發病機制尚不清晰,但該病的發生與多種因素有關,吸煙、空氣污染、病毒感染、基因多態性、性別、年齡等均與該病的發生存在密切聯系。研究[5]指出,吸入香煙煙霧是導致COPD的最主要因素之一。臨床實踐發現,香煙煙霧會誘導炎癥發生并直接導致肺組織的損害,對COPD發病機制的探究對針對性制訂防治策略具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長約18～22個核苷酸的小分子非編碼RNA,此類RNA能夠通過靶向與某些位點的結合,對靶蛋白的表達產生影響,進而干預細胞生長、分化、凋亡、能量代謝等生理功能[6]。miR-195目前發現在乳腺癌、肝癌、結直腸癌等多種病變中呈現高表達態[7]。本研究通過探究miR-195靶向抑制PH結構域富亮氨酸重復蛋白磷酸酶2(PH domain leucineme-rich repeat protein phosphatase 2,PHLPP2)參與香煙煙霧誘導急性肺損傷的機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 ①實驗動物:選擇健康清潔級小鼠90只,體重20～26 g,平均(22.36±2.01)g,購自北京隆安實驗動物養殖中心,許可證號SYXK(京)2014-0040。所有動物均于21～24 ℃的光照-暗循環12 h條件下實施標準化喂養,本次實驗所有操作和流程均符合《實驗動物管理條例》。②其他材料:小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽(GSH)ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司(批號ml002095、ml063162、ml037717、ml002070、ml643059、ml643115)。光學顯微鏡購自日本奧林巴斯(型號BX53P)。

1.2 研究方法 將所有小鼠隨機分為A、B、C三組,每組各30只。將A組小鼠作為正常對照組,B組小鼠作為低劑量干預組,C組小鼠作為高劑量干預組。對B、C兩組小鼠依據以往報道的方法[8]建立香煙煙霧誘導的急性肺損傷小鼠模型,其中B組小鼠暴露于5支香煙煙霧條件下,4次/d,每次間隔30 min不吸煙,5 d/周,共干預15周;C組小鼠暴露于10支香煙煙霧條件下,4次/d,每次間隔30 min不吸煙,5 d/周,共干預15周;當兩組小鼠肺部出現炎性反應,且病理檢查發現滲出性肺水腫則說明建模成功。A組小鼠不實施任何干預,暴露于常規空氣環境中。

1.3 觀測指標及評估標準

1.3.1 小鼠肺泡灌洗液炎癥細胞因子水平檢測:于末次暴露于香煙煙霧后18 h處死小鼠,分離其氣道進行插管,結扎左肺并實施肺泡灌注,取灌注液采用酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測灌注液中 TNF-α、IL-8及MMP-9水平,注意操作嚴格按照試劑盒說明書進行,每個指標檢測3次,取平均值作最終值。

1.3.2 小鼠肺泡灌注液炎癥細胞計數:取50 μl肺泡灌注液加入同等體積的白細胞計數液,于100倍光鏡下進行白細胞計數觀察,同時取肺泡灌注液離心后留沉淀做細胞涂片,室溫下干燥后染色,400倍光鏡下觀察細胞分類計數。

1.3.3 小鼠肺泡灌注液過氧化物質水平檢測:取三組小鼠肺組織,制作成為5%的肺勻漿,使用試劑盒檢測上層清液中MPO、SOD、GSH水平,并進行組間對比。

1.3.4 小鼠肺組織miR-195及PHLPP2蛋白表達檢測:取三組小鼠肺組織勻漿,提取總RNA后逆轉錄為cDNA后采用RT-PCR的方法測定肺勻漿中miR-195表達情況;選擇小鼠肺組織于-80 ℃條件下冰凍,取出后在液氮中研磨為粉末狀,加入裂解液制備組織勻漿,而后使用Westtern blot法檢測PHLPP2蛋白表達量,并進行組間對比。

2 結 果

2.1 三組小鼠肺泡灌洗液炎癥細胞因子水平對比 C組TNF-α、IL-8及MMP-9水平均高于B組,B組均高于A組,同時組間對比差異具有統計學意義(均P<0.05),見表1。

表1 三組小鼠肺泡灌洗液炎癥細胞因子水平對比

2.2 三組小鼠肺泡灌注液炎癥細胞計數對比 C組白細胞、中性粒細胞均高于B組,B組均高于A組,組間對比差異具有統計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 三組小鼠肺泡灌注液炎癥細胞計數對比(102/mm3)

2.3 三組小鼠肺泡灌洗液過氧化標志物水平對比 C組MPO、SOD、GSH水平高于B組,B組高于A組,組間對比差異具有統計學意義(均P<0.05),見表3。

表3 三組小鼠肺泡灌洗液過氧化標志物水平對比

2.4 三組小鼠肺組織miR-195及PHLPP2蛋白表達量對比 miR-195表達C組>B組>A組,PHLPP2蛋白表達C組

表4 三組小鼠肺組織miR-195及PHLPP2蛋白表達量對比

3 討 論

COPD是一種不完全可逆的以氣流受限為典型臨床特征的疾病,患者的氣流受限常呈進行性發展,具體可分為慢性支氣管炎和肺氣腫兩種疾病。流調學顯示,COPD居目前全球發病率第12位和死因第4位,有學者預計到2020年,COPD將成為僅次于冠心病和心腦血管疾病的第5位致殘和第3位致死疾病[9]。資料[10]表明,在美國COPD位居第4位致死原因,在歐盟居第3位,在我國COPD居第4位。據世界衛生組織(WHO)一項調研顯示,全球COPD患病率約為0.8%,臨床實踐指出,COPD危險因素包括吸煙、空氣污染、營養、遺傳等,在上述因素中,吸煙被認為是COPD最危險因素,約有10%～15%的人會罹患COPD,因而對吸煙如何誘導肺損傷機制的探究是改善COPD患者生活質量的重要途徑之一[11]。

隨著近些年分子生物技術的發展,miRNA在腫瘤及其他疾病中所發揮的作用逐漸被發掘出來,對miRNA的研究成為探究腫瘤發生發展、侵襲、轉移、治療等進程的重要手段。miR-195位于17號染色體長臂上,在以往的研究中,有多項研究證實該基因與多種癌癥進程存在密切聯系。張文昭等[12]通過將54例早期乳腺癌患者、58例良性乳腺癌患者及70例健康女性進行對比分析發現,早期乳腺癌患者血清中miR-195表達量明顯高于良性乳腺疾病組及健康對照組女性,同時經工作特征曲線分析顯示,miR-195歲早期乳腺癌診斷敏感度為70.0%,特異度為93.3%;王依等[13]則通過體外培養的方式發現,miR-195對肺癌細胞株A549的生長、凋亡及遷移等生物學行為產生影響,分析其原因為miR-195能夠通過靶向調控MYB基因來抑制A549細胞株的生長和遷移,促進其凋亡。PHLPP目前被發現能夠通過使Akt、蛋白激酶C及S6激酶相應保守位點去磷酸化來促進細胞凋亡并抑制細胞增殖,PHLPP2是PHLPP的一類。何曉燕等[14]通過將40例食管上皮內瘤變與63例食管鱗癌患者進行對比分析發現,良性病變患者組織中PHLPP2表達水平明顯高于食管鱗癌患者,而良性病變患者與正常對照組組織中水平對比差異并不明顯,進一步分析顯示PHLPP2還與食管鱗癌患者TNM分期有密切相關性,提示該蛋白可以作為食管鱗癌診斷指標之一。

本研究通過動物實驗的方式,就miR-195通過靶向PHLPP2來參與香煙煙霧誘導肺損傷進程進行了探究,結果顯示,使用香煙煙霧進行干預的B組及C組小鼠其肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-8及MMP-9水平明顯高于空氣干預的A組小鼠,同時B、C兩組小鼠其白細胞和中性粒細胞計數也明顯升高,MPO、SOD、GSH等過氧化物指標水平也有提升,分析認為,煙霧誘導會導致小鼠肺組織出現急性炎性反應,其機制為煙霧能夠激活上皮細胞和巨噬細胞使其釋放趨化因子從而吸引炎癥細胞進入肺部[15-17]。最后本研究結果還提示,B、C兩組小鼠其肺組織中miR-195表達量明顯高于A組小鼠,PHLPP2表達量明顯低于A組小鼠,分析認為,PHLPP2能夠通過去磷酸化使Akt失活,從而抑制細胞的凋亡,本研究中PHLPP2屬于miR-195的靶點,miR-195的過表達能夠下調PHLPP2的水平,進而提高了Akt在細胞中的磷酸化水平,通過正調控Akt磷酸化,從而加快肺泡細胞的凋亡,加重肺組織的炎性反應和損傷進程[18-20]。

綜上所述,香煙煙霧能夠誘導小鼠肺組織出現炎性改變,分析其原因與miR-195過表達并抑制PHLPP2蛋白表達有關。