骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)放射性涎腺損傷大鼠實(shí)驗(yàn)研究

梁 珉,劉 莉

(1.三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院口腔科,湖北 宜昌443000;2.國藥葛洲壩中心醫(yī)院口腔科,湖北 宜昌443000)

頭頸部惡性腫瘤患者多采用手術(shù)、綜合治療、放化療等,而在放化療中電子直線加速器為常用醫(yī)療設(shè)備,雖然可高效殺滅腫瘤細(xì)胞,但同時可對涎腺細(xì)胞增殖起到抑制作用,進(jìn)而造成了細(xì)胞凋亡,最終對涎腺功能造成了影響[1-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是可支持骨髓造血干細(xì)胞的組織工程,主要在骨髓基質(zhì)中所存在,具有體外培養(yǎng)快速增殖的優(yōu)點(diǎn),在心肌細(xì)胞損傷、牙髓組織再生、腦損傷、腎臟衰竭等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床及基礎(chǔ)研究中應(yīng)用,可較好的修復(fù)組織原有功能[4-5]。目前臨床關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在放射性涎腺損傷的應(yīng)用研究較少,一些外文文獻(xiàn)中也僅僅集中在一個層面上進(jìn)行分析。基于此,本研究對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對放射性涎腺損傷大鼠的干預(yù)效果進(jìn)行分析,以期為放射性涎腺損傷的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 取30只SPF級Wistar大鼠,體重210～240 g,由北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司提供,動物許可證號SYXK(京)2019-0025,所有大鼠在無病原菌,相對濕度、室溫分別為50%、23 ℃的籠子中進(jìn)行喂養(yǎng),所使用的水、食物均經(jīng)高溫高壓殺毒,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。根據(jù)實(shí)驗(yàn)時間取1只周齡SPF乳鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)。本試驗(yàn)操作均參照動物試驗(yàn)倫理要求的相關(guān)規(guī)定,且經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)同意。倒置顯微鏡(上海無陌光學(xué)儀器有限公司);流式細(xì)胞儀[安捷倫科技(中國)有限公司];PBS(武漢普諾賽生命科技有限公司);羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)(西安齊岳生物科技有限公司);毛果蕓香堿(湖北日升昌新材料科技有限公司);Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海玉博生物科技有限公司);鼠源性一抗(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司);PCR試劑盒(南京歐凱生物科技有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與建模:適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,取30只大鼠,10只作為空白組,剩余20只參照高彥辰等[6]建立放射性涎腺損傷模型,取大鼠將其斷頸處死,在無菌條件中將頜下腺分離放置在平皿內(nèi),通過胰酶消化的方法取得其頜下腺細(xì)胞,將其在培養(yǎng)箱內(nèi)接種并培育,1 d后經(jīng)差速貼壁的方式將細(xì)胞予以純化,接著每隔3 d調(diào)換培養(yǎng)液1次,可取得正常水平培養(yǎng)下的頜下腺細(xì)胞,可在每一次換液之前用光鏡下觀察大鼠的細(xì)胞狀態(tài)并記錄,在培養(yǎng)原代3 d之后,將細(xì)胞制作成為單細(xì)胞懸液,分別對大鼠頭頸部經(jīng)一次性的鈷予以照射1～9 min,放射源選擇60Co γ射線,對照射視野2 cm×3 cm,大鼠與照射源的距離為80 cm,參數(shù)設(shè)置為1250 cGy/min,1次/d,2 Gy/次,共照射5 d,中間間隔2 d繼續(xù)照射,總照射劑量為30 Gy。完成照射后,一部分的細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育,另一部分細(xì)胞按3×104個/ml在96孔板內(nèi)接種,每個孔為120 μl,繼續(xù)孵育。分別在結(jié)束照射后的1、3、5 d通過倒置顯微鏡對其進(jìn)行檢測記錄,最后將建模成功的20只大鼠分為放射對照組、實(shí)驗(yàn)組各10只。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng):建模成功后第2天對大鼠進(jìn)行干預(yù),取大鼠將其斷頸處死,在無菌環(huán)境下用PBS洗滌骨髓腔,集取細(xì)胞懸液進(jìn)行離心后,取每個細(xì)胞核分別在培養(yǎng)皿內(nèi)接種,并將其標(biāo)記出原代,在培養(yǎng)皿中鋪骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞80%左右,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 治療方法:取2代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,消化胰酶成為單細(xì)胞懸液,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定,取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第2代,滴加5 μmol/L羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE),放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30～35 min,經(jīng)PBS洗滌3～4次,以此計(jì)算每組的熒光標(biāo)記率。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射100 μl骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液,1次/d,共注射7 d,空白組、放射對照組不做干預(yù),正常喂養(yǎng)。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 大鼠一般情況:觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液干預(yù)前空白組大鼠及建模大鼠毛發(fā)色澤、精神狀況、活動情況、飲食等一般情況。

1.3.2 唾液流量檢測:待大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液干預(yù)完成后,對各組大鼠進(jìn)行麻醉,之后將大鼠氣管切開,將4 mg/kg毛果蕓香堿注入大鼠頸部皮下,對其唾液分泌進(jìn)行刺激,共收集30 min,以重量代表體積,對唾液流量進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)檢測:麻醉后取大鼠腮腺、下頜下腺組織,稱取濕重量,計(jì)算腮腺、下頜下腺指數(shù)=腮腺(下頜下腺)質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.3.4 病理學(xué)觀察:于上述指標(biāo)檢測完成后,取大鼠腮腺組織,經(jīng)脫水、石蠟包埋處理后,做HE染色,光鏡下觀察病理形態(tài)改變。

1.3.5 細(xì)胞增殖檢測:選取MTT比色法對細(xì)胞增殖情況予以檢測,將所檢測的細(xì)胞濃度調(diào)至4×104個/ml,將待測細(xì)胞接種于96孔板中,每個孔內(nèi)滴加220 μl的細(xì)胞懸液經(jīng)24、48、72 h培養(yǎng)后(培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2)加入15 μl MTT試劑,培養(yǎng)4 h,通過酶標(biāo)儀檢測其OD值,算出增殖率。細(xì)胞增殖率=檢測細(xì)胞組OD值/空白組OD值×100%。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.6 細(xì)胞凋亡檢測:應(yīng)用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況,將所培育的細(xì)胞清洗、DAPI染色封片后的細(xì)胞核顯現(xiàn)出綠色熒光,其中綠色熒光表示陽性細(xì)胞數(shù),接著用熒光顯微鏡對細(xì)胞凋亡情況予以觀察計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù),細(xì)胞凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)測定3次。

1.3.7 水通道蛋白5(AQP5) mRNA表達(dá)量檢測:取1.3.4待檢大鼠腮腺組織,AQP5 mRNA表達(dá)量通過實(shí)時熒光定量法進(jìn)行鑒定,提取總RNA,將腮腺組織中的RNA使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動PCR儀。通過2-△△Ct方法計(jì)算出AQP5的mRNA表達(dá)量。AQP5上游、下游引物序列分別為:5’-CATCTTCTCCTCCACCGACTCT-3’、5’-GGGTGCTTCAAACT-CTTCGTC-3’;內(nèi)參GAPDH上游、下游引物序列分別為:5’-GCTTVGGCACATATACTAAAAT-3’、5’-CGCTTCACGAATTTGAGTGTCAT-3’。

1.3.8 AQP5蛋白相對表達(dá)量檢測:通過Western blot對腮腺組織中的AQP5蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行檢測,將各組大鼠腮腺組織剪碎后加入裂解液,進(jìn)行30 min裂解,以離心半徑3 cm,轉(zhuǎn)速3000 r/min離心處理10 min,取上清液,做BCA蛋白定性檢測,將樣品上樣至8%SDS-PAGE凝膠上,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用PBS封閉2 h后,加入TBST稀釋的羊抗鼠AQP5(1∶2500)一抗,后4 ℃孵育過夜,洗膜3次,加入1∶10000的稀釋羊抗鼠二抗,溫室孵育1 h,做TBST洗膜3次,以GAPDH為內(nèi)參照,定量分析蛋白表達(dá)情況,重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 空白組大鼠體重、精神狀況、飲食、進(jìn)水均無明顯變化,建模大鼠進(jìn)食、進(jìn)水減少,頸部毛發(fā)光澤度下降,精神狀態(tài)不佳。

2.2 各組大鼠唾液流量對比 見表1。與空白組相比,放射對照組、實(shí)驗(yàn)組唾液流量水平下降(均P<0.05);與放射對照組相比,實(shí)驗(yàn)組唾液流量水平上升(均P<0.05)。

表1 各組大鼠唾液流量對比(ml/30 min)

2.3 各組大鼠腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)對比 見表2。與空白組相比,放射對照組、實(shí)驗(yàn)組腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)水平下降(均P<0.05);與放射對照組相比,實(shí)驗(yàn)組腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)水平上升(均P<0.05)。

表2 各組大鼠腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)對比(%)

2.4 各組病理學(xué)特征對比 見圖1。空白組大鼠腺泡呈球狀、排列整齊,腮腺組織結(jié)構(gòu)清晰完整,腺葉間有纖維組織間隔,放射對照組大鼠腺葉間纖維化間隙增大,胞漿染色加深,實(shí)驗(yàn)組大鼠少許腮泡出現(xiàn)變形、收縮。

圖1 各組病理學(xué)特征對比(HE染色,×400)

2.5 各組細(xì)胞增殖率對比 見表3。與對照組對比,放射對照組細(xì)胞增殖率上升,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率降低(均P<0.05);與放射對照組對比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率下降(P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞增殖率對比 (%)

2.6 各組細(xì)胞凋亡率對比 見表4。與對照組比較,放射對照組細(xì)胞凋亡率下降,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率上升(均P<0.05);與放射對照組比較,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。

表4 各組細(xì)胞凋亡率對比(%)

2.7 各組AQP5 mRNA表達(dá)量對比 見表5。與空白組相比,放射對照組、實(shí)驗(yàn)組AQP5 mRNA表達(dá)量下降(均P<0.05);與放射對照組相比,實(shí)驗(yàn)組AQP5 mRNA表達(dá)量上升(P<0.05)。

表5 各組AQP5 mRNA表達(dá)量對比

2.8 各組AQP5蛋白相對表達(dá)量對比 見表6。與空白組相比,放射對照組、實(shí)驗(yàn)組AQP5相對表達(dá)量下降(均P<0.05);與放射對照組相比,實(shí)驗(yàn)組AQP5相對表達(dá)量上升(P<0.05)。

表6 各組AQP5蛋白相對表達(dá)量對比

3 討 論

舌下腺、下頜下腺、腮腺為主要涎腺,其解剖位置多位于頭頸部惡性腫瘤的淺表或者腫瘤組織相交處,對放射中產(chǎn)生X線敏感性較高,因此在治療的同時X線對舌下腺、下頜下腺、腮腺等涎腺會造成一定的損傷,進(jìn)而造成涎腺分泌功能下降或完全喪失,隨著病情的發(fā)展易引發(fā)發(fā)音障礙、灼口綜合征、味覺喪失、吞咽困難等并發(fā)癥,最終對患者生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響[6-8]。目前臨床多通過使用促涎腺生成藥物、放療前行下頜下腺腺體轉(zhuǎn)移、改進(jìn)放療技術(shù)等手段改善放射性損傷涎腺,但仍不能達(dá)到長期改善涎腺腺體組織、功能的治療目的,因此尋找新型治療手段具有關(guān)鍵意義[9-10]。

當(dāng)前治療放射性涎腺損傷的手段有限,因此通過組織工程對放射性損傷涎腺功能進(jìn)行重建成為患者生存質(zhì)量提升的關(guān)鍵所在,但組織工程中對正常涎腺細(xì)胞需求量較大,因此找尋涎腺細(xì)胞的種子細(xì)胞為目前首要目標(biāo)[11-13]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為包含中胚層、外胚層、內(nèi)胚層的多數(shù)細(xì)胞類型,且可分泌免疫調(diào)節(jié)因子、血管形成因子、外泌體等生物活性因子,在組織的修復(fù)、再生中具有重要作用[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn),放射性涎腺損傷大鼠經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后唾液流量、AQP5蛋白相對表達(dá)量增加,腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)水平上升,腮腺組織結(jié)構(gòu),腺葉間組織結(jié)構(gòu)改善,提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可修復(fù)放射性涎腺損傷。

涎腺是可產(chǎn)生唾液并經(jīng)導(dǎo)管系統(tǒng)進(jìn)入口腔內(nèi)的外分泌腺,在發(fā)生損傷后可出現(xiàn)唾液流量下降,唾液成分及性質(zhì)改變,而上述改變不僅可對口腔生物環(huán)境造成影響,且可引發(fā)黏膜炎、猖獗性齲等,同時可造成腮腺、下頜下腺體積縮小,對機(jī)體影響較大[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),放射性涎腺損傷大鼠經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后唾液流量增加,腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)水平上升。相關(guān)學(xué)者[19]研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)組織修復(fù)、再生,進(jìn)而對涎腺組織功能恢復(fù)起到了促進(jìn)作用,與本文研究結(jié)果一致,提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可改善放射性涎腺損傷大鼠涎腺功能。

AQP5是一種在胃腸道、淚腺腺泡、肝臟、胰腺上皮、腎上皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞中均有存在的特異轉(zhuǎn)運(yùn)水蛋白質(zhì),可參與涎腺唾液分泌,且可抑制腺泡細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn),放射性涎腺損傷大鼠經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后AQP5表達(dá)量增加。有關(guān)研究[21]表明,AQP5是構(gòu)成涎腺損唾液分泌的主要通道之一,可發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)水的功能,在涎腺損傷時可參與細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而降低了腺泡細(xì)胞凋亡,改善了涎腺組織功能,與本文結(jié)論保持一致。提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過調(diào)控AQP5表達(dá)而修復(fù)涎腺損傷。

綜上所述,放射性涎腺損傷發(fā)生后伴隨唾液流量減少,腮腺指數(shù)、下頜下腺指數(shù)水平下降等表現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)后上述情況改善,其機(jī)制可能與AQP5表達(dá)量增加有關(guān)。