不同水稻品種光合特性及葉綠素對臭氧濃度升高的響應差異

何龍鑫，徐彥森，馮兆忠，張涵，曹蓉，鐘鑫，馬艷澤

（南京信息工程大學應用氣象學院，中國氣象局生態系統碳源匯重點開放實驗室，江蘇省農業氣象重點實驗室，南京 210044）

近地層臭氧（O3）是由氮氧化物（NOx）、揮發性有機化合物（VOCs）等O3前體物經過光化學反應形成的[1]，對植被具有毒害作用[2-4]。隨著工業化、城市化進程的不斷加快以及人類活動的日益加劇，過去幾十年里北半球中緯度地區的O3濃度以每年0.5%～2%的速度持續增長[5-6]，且一些地區O3濃度的平均小時最高值可達109 nmol·mol-1，遠超O3對植物的危害閥值濃度（40 nmol·mol-1）[7-8]。近幾年我國O3濃度急速上升，O3污染對我國糧食作物的生長產生了巨大影響[9]，造成了嚴重的經濟損失[10]。據研究統計，當前O3污染導致我國水稻、小麥和玉米的相對產量損失分別達到23%、33%和9%[11]，僅2014—2017 年，O3污染就導致長江三角洲地區水稻年平均減產2.445×109t，約占實際產量的9.1%，造成年平均經濟損失達10.37 億美元[12]。

O3通過葉片氣孔進入質外體后，形成活性氧自由基（ROS）并引發氧化脅迫。當作物長時間暴露在高濃度O3下，ROS 的累積量一旦超過植物自身的解毒防御閾值，便會導致細胞程序性死亡，從而加速葉片衰老、降低葉綠素含量、抑制葉片光合作用，進而造成產量下降[13-14]。因此，探究不同水稻品種O3敏感性的差異，選育O3耐受性品種將有利于應對O3污染對水稻產量的危害[15]。目前研究人員已經開展了大量O3熏蒸對水稻光合作用[16]、生理生化[17]、地上生物量、產量[18]以及限制因素[19-20]等方面的影響研究。O3濃度升高降低作物產量主要是由于O3通過氣孔進入作物體內破壞了光合作用機制，從而減少同化物的積累，并改變同化物的分配[21]。利用光合速率變化可以有效并快速評估不同水稻品種O3敏感性并揭示其機理。如Pang 等[22]在整個水稻生育期進行1.5 倍大氣O3濃度熏蒸試驗，通過光合速率和產量指標揭示了汕優63 的O3敏感性強于武育粳3 號。因此，研究O3對不同水稻品種光合作用的影響差異是揭示水稻品種O3敏感性的重要手段。

Shi 等[23]基于自由式O3濃度增加系統（O3-FACE）研究了O3濃度升高對4個我國水稻品種產量的影響，結果表明雜交稻品種比常規稻品種產量損失更大，這可能與O3濃度升高抑制了雜交稻品種每穗穎花數的形成有關[24]。研究顯示，O3濃度升高會對汕優63 的品質產生不利影響[25-26]。目前已經開展了一些水稻的O3-FACE 試驗，但其中大部分試驗品種單一，只測試了汕優63、武育粳3號等個別品種。關于O3濃度升高下多個雜交稻和常規稻品種的響應差異鮮有研究，對雜交稻和常規稻的O3敏感性差異了解還不夠。探究O3熏蒸對多個不同水稻品種的影響差異不僅可為選育O3耐受性品種提供參考，而且有利于更精準地采取減緩O3濃度升高對水稻傷害的防護措施，從而降低O3污染對水稻產量的不利影響。因此，本試驗利用O3-FACE 平臺，設置兩個O3處理，在水稻生長的全生育期對4 個雜交稻品種和8 個常規稻品種進行O3熏蒸試驗，探究不同水稻品種間以及雜交稻和常規稻間對O3濃度升高的葉片光合特性指標及葉綠素的響應差異，為選育O3抗性的水稻品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地點位于江蘇省揚州市江都區（32°25′ N，119°43′ E），地處長江三角洲，屬于亞熱帶濕潤氣候。當地長期實行稻麥輪作體系，是典型的農田生態系統，2009—2018 年平均氣溫和年平均降水量分別為16.2 ℃和1 131.3 mm，年日照時間為1 936.1 h，年無霜期＞290 d。

1.2 試驗設計

本試驗在O3-FACE 平臺中進行，平臺中設有O3升高（E-O3）圈和環境大氣（A-O3）圈各4 個。每個圈均為直徑14 m的正八面形，通過圍成正八角形的8根PPR管上的許多小孔向圈中心噴射O3氣體，PPR管位于作物冠層上方20 cm 左右，計算機系統通過圈中心傳感器對大氣中O3濃度進行實時監測，自動調節混合氣體中的O3濃度，從而控制E-O3圈內O3濃度保持為A-O3圈內O3濃度的1.5 倍。O3熏蒸從2021 年7 月13日開始，10月28日停止，共計108 d，每日熏氣時間為8：00—18：00，雨天關閉設備停止通氣，暫停熏蒸天數為23 d，有效熏蒸天數為85 d。整個熏蒸期間內，A-O3圈的O3濃度日均值為36.4 nmol·mol-1，E-O3圈的O3濃度日均值為52.9 nmol·mol-1。A-O3圈只對冠層空氣O3濃度進行監測，其余環境條件均與自然環境條件一致。

本試驗分別在A-O3圈和E-O3圈內設置長寬各3 m 的試驗樣地。每個試驗樣地內分別種植12 個水稻品種，包括4 個雜交稻品種（甬優2640、揚兩優6 號、汕優63、豐優香占）和8 個常規稻品種（淮稻5 號、金香玉1號、南京16、南粳5055、南粳9108、武育粳3號、武運粳24、揚稻6號）。2021年6月27日人工插秧，自西向東依次種植雜交稻和常規稻，為保證試驗隨機性，雜交稻內和常規稻內分別隨機種植，南北向為同一品種，每個水稻品種種植13穴，每穴間隔為25 cm，每兩個供試水稻品種間隔25 cm，雜交稻與常規稻的相鄰分界間隔30 cm。試驗樣地采用大田常規田間管理方式。圖1為O3熏蒸期間A-O3處理與E-O3處理的白天10 h平均O3濃度變化。

1.3 指標測定

1.3.1 光合特性指標的測定

采用Li-6800便攜式光合測定儀（LI-COR，美國）分別于9 月21 日（灌漿前期）和10 月2 日（灌漿中期）測定葉片光合特性指標。具體測定方法為：晴天的9：00—11：30，在每個試驗樣地內選取每個品種光照條件好、長勢較一致的旗葉葉片進行光合特性指標測定，測定時光合有效輻射設置為1 500 μmol·m-2·s-1，CO2濃度設置為410 μmol·mol-1。光合特性指標包括：飽和光合速率（Asat）、氣孔導度（gs）、葉片胞間CO2濃度（Ci）、瞬時水分利用效率（WUE）以及表觀光合電子傳遞效率（ETR），其中WUE通過Asat與gs的比求得。

1.3.2 葉綠素總量的測定

分別于9 月21 日和10 月2 日選取完成光合特性指標測定的葉片，用打孔器取直徑為0.7 cm的圓形葉片，將其放入2 mL 95%的乙醇中浸泡，并放入4 ℃冰箱中黑暗保存直至完全褪色。將提取液分別于664、649 nm 與470 nm 處測定吸光度，并根據Lichtenthaler[26]的方法得到葉綠素總量（Total chl）。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2016 對試驗數據進行初步整理，利用JMP 11.0檢驗數據的正態性與方差齊性，統計分析采用裂區試驗設計，以O3處理為主區，品種為裂區，運用JMP 11.0 中的裂區設計方差模型對各變量進行方差分析，采用t雙尾檢驗分析單一品種不同O3處理下各變量的顯著性差異。采用Origin 2022制圖，柱形圖中的數據為平均值±標準誤差（SE）。

2 結果與分析

2.1 O3濃度升高對不同水稻品種的影響

灌漿前期，O3濃度升高顯著降低了供試水稻的Asat和gs（P＜0.01），不同品種的Asat和gs的差異也均達到顯著水平（P＜0.05）。灌漿中期，O3濃度升高顯著降低了供試水稻的Asat（P＜0.05），且不同品種的Asat的差異也達到顯著水平（P＜0.05），而gs變化不顯著。在任一生育期，O3與品種間的交互作用均未對Asat和gs產生顯著影響（圖2）。

由圖2（a）和圖2（b）可見，O3濃度升高下，灌漿前期豐優香占、灌漿中期揚兩優6號和揚稻6號的Asat分別顯著下降16.7%、40.4%和22.0%。由圖2（c）和圖2（d）可見，O3濃度升高下，灌漿前期南粳9108、武運粳24 和灌漿中期揚兩優6 號的gs分別顯著下降31.6%、35.1%和47.5%，其余品種的Asat和gs變化均不顯著。

圖2 O3濃度升高對不同水稻品種葉片飽和光合速率（Asat）和氣孔導度（gs）的影響Figure 2 Effects of elevated O3 concentration on light-saturated photosynthetic rate（Asat）and stomatal conductance（gs）in leaves of different rice cultivars

如圖3所示，兩個時期O3濃度升高對供試水稻的Ci和WUE 值均無顯著影響，不同品種的Ci和WUE 值的差異均達到顯著水平。O3和品種間的交互作用對Ci和WUE的影響在灌漿前期達到顯著水平（P＜0.01）。

由圖3（a）和圖3（b）可見，O3濃度升高下，灌漿前期武運粳24的Ci值顯著下降，淮稻5號在兩個時期的Ci值均顯著變化。由圖3（c）和圖3（d）可見，O3濃度升高下，武運粳24 在灌漿前期的WUE 值顯著上升38.9%，淮稻5 號在灌漿前期和灌漿中期的WUE 值分別顯著上升28.1%和顯著下降26.5%，其余品種的Ci和WUE值變化均不顯著。

圖3 O3濃度升高對不同水稻品種葉片胞間CO2濃度（Ci）和瞬時水分利用效率（WUE）的影響Figure 3 Effects of elevated O3 concentration on intercellular CO2 concentration（Ci）and instantaneous water use efficiency（WUE）in leaves of different rice cultivars

如圖4所示，兩個時期O3濃度升高對供試水稻的ETR 值和Total chl 值均無顯著影響，而不同品種Total chl 值的差異在兩個時期均達到顯著水平（P＜0.01），不同品種的ETR 值差異在灌漿中期達到顯著水平（P＜0.05）。在任一生育期，O3與品種間的交互作用均未達到顯著水平。灌漿前期O3濃度升高下甬優2640和豐優香占的ETR 值分別顯著下降34.2%和32.0%，其余品種的ETR值和Total chl值變化均不顯著。

圖4 O3濃度升高對不同水稻品種葉片表觀光合電子傳遞效率（ETR）和葉綠素總量（Total chl）的影響Figure 4 Effects of elevated O3 concentration on apparent photosynthetic electron transfer efficiency（ETR）and total chlorophyll（Total chl）in leaves of different rice cultivars

2.2 O3濃度升高對雜交稻和常規稻的影響

由表1 可知，雜交稻在O3濃度升高下，Asat和ETR值在灌漿前期分別平均顯著下降15.1%和24.5%，在灌漿中期均無顯著變化；gs在灌漿前期變化不顯著，在灌漿中期平均顯著下降27.4%；WUE由灌漿前期的小幅度下降變為灌漿中期的小幅度上升。在O3濃度升高下，常規稻的Asat在兩個時期變化均不顯著，gs在灌漿前期平均顯著下降20.2%，但在灌漿中期變化不顯著；ETR 由灌漿前期的幾乎不變到灌漿中期的下降；WUE 由灌漿前期的上升變為灌漿中期的小幅度下降。雜交稻和常規稻的Ci在兩個時期幾乎維持不變，Total chl在灌漿中期下降。

3 討論

光合作用是作物積累有機物的主要過程，可維持作物的生長。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，是影響光合作用的重要因子。隨著水稻進入灌漿期，植株內部碳、氮代謝發生變化，光合機構不斷損傷，上部葉片的光合功能迅速衰退，葉片逐漸衰老，葉綠素含量逐漸降低，O3濃度升高會加速這一進程。本研究發現，灌漿中期水稻的Asat、gs和Total chl 值普遍低于灌漿前期，這主要與O3濃度升高對水稻生長的影響具有累積效應有關。不同水稻品種的光合特性對O3脅迫的響應差異顯著，且雜交稻的Asat、gs和ETR值的響應比常規稻更明顯，表明雜交稻比常規稻對O3脅迫更敏感。O3具有強氧化性，高濃度O3通過葉片氣孔進入植物體內會損害葉片表觀特征，導致葉片的光合速率降低[27-29]。進入質外體的O3通量受氣孔交換速率的調控，而氣孔數量、大小以及開度等又決定了O3進入質外體空間的速率[30]，由此可見，氣孔因素對于調控植物對O3的吸收有重要作用。Ainsworth等[31]對在O3-FACE 中進行的水稻試驗進行整合分析發現，相較于過濾空氣環境，水稻在O3濃度為59 nmol·mol-1的環境中生長時，其葉片Asat平均下降28%，在O3濃度為55 nmol·mol-1的環境中生長時，其葉片gs平均下降23%。本試驗中，灌漿前期和灌漿中期分別有豐優香占、揚兩優6號和揚稻6號的Asat顯著下降，其他品種的Asat變化不顯著，這表明不同水稻品種的Asat對O3脅迫的響應存在差異，且豐優香占、揚兩優6 號和揚稻6 號對O3較敏感。研究普遍發現O3濃度升高會導致植物gs下降，gs降低一方面限制CO2的進入、降低光合作用，另一方面也是植物應對O3濃度升高的一種保護性機制[32]，即植物通過降低gs來減少進入體內的O3通量，從而抵抗O3濃度的升高[33]。本試驗中，兩個時期均有不同品種的gs顯著下降，表明O3濃度升高對不同水稻品種的gs的影響存在差異。

O3濃度升高可以通過氣孔因素和非氣孔因素共同影響Asat，Ci是水稻光合作用的直接限制因子，其變化方向是判斷光合速率變化主要受氣孔因素還是非氣孔因素影響的重要依據。Feng 等[19]利用O3-FACE探究O3濃度升高對5 個冬小麥品種光合作用影響的差異時發現，O3對不同冬小麥品種光合作用影響的差異主要取決于非氣孔因素（如抗氧化酶）而不是gs。本試驗中，在兩個時期不同水稻品種的Asat和gs下降的同時，大部分品種的Ci幾乎維持不變且ETR發生不同程度的變化，這說明O3濃度升高對不同水稻品種影響的差異主要由于ETR、葉肉細胞同化能力等非氣孔因素的限制。灌漿前期雜交稻的Asat和ETR值顯著下降，常規稻的Asat小幅度下降且ETR值維持不變，這表明O3濃度升高對雜交稻和常規稻的光合作用影響存在差異，且對雜交稻影響更大，其差異可能與ETR的限制有關。

WUE 是解釋植物固碳耗水權衡關系的重要指標，提高WUE 有利于提高植物單位耗水能力下的碳固定量?，F有研究利用O3-FACE 分別探究了O3濃度升高對幾個水稻品種的WUE、光合生化能力和Ballberry 模型參數的影響。Masutomi 等[34]通過光合模型模擬發現，高濃度O3主要是通過影響汕優63 的葉片光合和氣孔回歸關系中的截距來降低葉片的WUE。在本研究中，O3濃度升高下常規稻的WUE 由灌漿前期的上升變為中期的小幅度下降，造成這種變化的原因主要是O3濃度升高導致灌漿中期大部分常規稻品種葉片光合作用降低大于gs的降低，光合與氣孔呈現解耦合關系[35]，進而導致WUE 降低。研究發現O3濃度升高會降低葉片葉綠素含量[36]，促進膜脂過氧化作用，損害水稻膜系統，促使葉片葉綠素降解導致的葉綠素含量迅速下降并加劇葉片衰老。本試驗中，O3濃度升高下不同水稻品種Total chl 主要在灌漿中期下降，且雜交稻和常規稻的響應相似，這主要與葉綠素含量對O3濃度升高的響應具有累積效應有關[19]。

水稻光合速率變化是有效且快速評估不同水稻品種O3敏感性的重要依據?？紤]到不同品種生育期對O3響應的差異，本試驗利用O3濃度升高下水稻品種兩個時期Asat下降均值并結合變化顯著性進行不同品種O3敏感性的篩選。本研究中僅揚兩優6 號在兩個時期的Asat下降均值大于25%，且其Asat在灌漿中期顯著下降，表明揚兩優6 號對O3敏感性最強；淮稻5號和南粳5055 在兩個時期的Asat下降均值小于10%，且其Asat在兩個時期變化均不顯著，表明供試品種中淮稻5 號和南粳5055 對O3抗性強。現有研究表明相比于常規稻，O3濃度升高下雜交稻的響應變化更明顯[22-23]。本研究中，O3濃度升高下雜交稻比常規稻的光合特性指標響應更顯著，且更多的常規稻品種的O3抗性更強，如淮稻5號、南粳5055等，這表明雜交稻比常規稻對O3脅迫更敏感?？傊?，本研究結果表明，O3濃度升高對不同水稻品種光合作用的影響存在差異，對葉綠素影響差異不顯著，雜交稻的O3敏感性強于常規稻。未來可結合水稻品種抗氧化特性、產量構成等指標驗證本試驗結論并進一步深入研究，為研究不同水稻品種對高濃度O3脅迫的響應機制提供可靠依據，為O3耐受性品種選育以及減緩O3污染對水稻的影響提供科學指導。

4 結論

O3濃度升高下不同水稻品種間光合作用響應存在品種差異，葉綠素含量變化差異不顯著，雜交稻比常規稻對O3脅迫的敏感性更強。O3濃度升高對不同水稻品種光合作用影響的差異主要由于電子傳遞速率等非氣孔因素的限制?；谒撅柡凸夂纤俾首兓?，本試驗選用的品種中揚兩優6 號對O3最敏感，淮稻5號和南粳5055對O3抗性強，這2個抗性品種在O3污染下可廣泛種植。