基于Hedgehog信號通路探討補腎中藥靶向治療骨質疏松癥的機制研究進展

楊軍 鄧強 李軍杰 喬小萬

【摘 要】 中醫學將骨質疏松癥歸于“骨痹”“骨痿”等范疇，并認為腎精不足、骨髓生化乏源、骨骼失養是“骨痿”等疾病的主要病機。近年來，隨著現代分子生物學的發展，對骨代謝信號通路和相關作用靶點基因的認識不斷深入，研究發現Hedgehog信號通路在骨骼發育中發揮著關鍵作用，其傳導異常可導致骨質疏松癥等骨代謝疾病的發生。以Hedgehog信號通路在骨質疏松癥發病過程中的作用機制為基礎，探討經典補腎中藥及中藥復方通過此通路治療骨質疏松的具體機制，從而為具有補腎功效的單味中藥及復方臨床應用提供基礎研究支撐，為今后相關中藥的研發提供參考。

【關鍵詞】 骨質疏松癥；Hedgehog信號通路；補腎中藥；機制；研究進展；綜述

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是多種病因共同作用于人體導致的骨密度和骨質量下降，骨微結構破壞，造成骨脆性增加，從而容易發生骨折為特征的全身性骨代謝性疾病，已成為全球患病率、致殘率最高，治療費用最昂貴的疾病之一，嚴重威脅中老年男性、絕經后婦女、部分青少年等群體骨骼健康［1-2］。流行病學研究顯示，我國年齡 > 50歲人群OP患病率為19.2%，年齡 > 65歲人群患病率為32.0%［3］。我國低骨量人群數量巨大，年齡 > 50歲的人群低骨量率高達46.4%，是未來患OP的高危人群［4-5］。OP在中老年骨病中居首位［6］，造成的骨折嚴重影響患者生活質量及老年人壽命，醫療承受了巨大負擔。

中醫學將OP歸屬于“骨痹”“骨痿”等范疇，中醫理論認為“腎為先天之本”“腎生骨髓”“五藏所主，……腎主骨”“其充在骨”，骨骼的生長發育、強勁、衰弱與腎精盛衰關系密切，腎精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養而強健有力；腎精虧虛則骨髓生化乏源，骨骼失養而萎弱無力。《靈樞·經脈》指出：“足少陰氣絕則骨枯……骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻發無澤者骨先死。”指出腎虛是引起骨痿的主要病機，說明幾千年前中醫學就確立了“腎主骨”的指導思想，建立了“腎-精-髓-骨”骨骼內在化生體系，即腎精對骨的充實與濡養發揮著重要作用，主導著骨的生長發育、生理功能的發揮，是人體骨代謝的內環境［7-9］，從而為補腎填精法治療OP提供了最基本的理論依據。近年來臨床以骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和膳食補充劑等西藥治療為主，在緩解或消除疼痛、改善骨代謝的同時，具有胃腸道不良反應多、治療費用高昂等缺點。而中醫藥在慢性代謝性疾病的臨床應用中緩解了西藥諸多不良反應，且價格低廉，臨床效果良好［10］。Hedgehog信號通路在骨代謝過程中起重要調控作用，近年在骨科研究中備受關注。該通路主要對骨形成和骨髓間充質干細胞（BMSCs）的成骨進行調控［11］。本文在查閱大量國內外文獻后就補腎中藥基于Hedgehog信號通路靶向治療OP的機制研究作一綜述，以期為治療OP的中藥研發及臨床診療提供參考。

1 OP與Hedgehog通路

破骨細胞與成骨細胞的穩態失衡，骨代謝紊亂，從而導致OP［12］。治療上主要為抑制骨吸收、促進骨形成及膳食補充等手段，達到緩解或消除疼痛，增加骨密度，進而降低骨折的風險。Hedgehog信號通路調控成骨細胞的分化增殖，提升骨量，達到防治OP的作用。Hedgehog通路由Hedgehog蛋白、Gli蛋白、Ptched（Ptc）、Smoothened（Smo）抗體以及下游靶基因組成［13］。Hedgehog信號通路是通過Hedgehog蛋白促進成骨細胞的骨形成功能，達到骨形成與骨吸收之間的平衡。Gli蛋白在脊椎動物骨骼中主要有Gli1、Gli2和Gli3三型（Gli1和Gli2蛋白主要為激活下游靶基因而活化Hedgehog通路，Gli3為抑制因子，可阻礙通路傳導）。首先，當該通路Hedgehog蛋白匱乏時，Ptc直接與Smo聯結，使其活性降低，并抑制下游靶基因的轉錄過程。若Hedgehog蛋白表達正常則與Ptc結合，消除Ptc對Smo活性的抑制作用，從而促進Gli1蛋白激活下游靶基因的轉錄，促進成骨細胞增殖，從而促進受損骨組織的修復［14］，達到抗OP的作用。其次，Runx2和Osx是骨形成過程中的重要轉錄因子，其表達過程多個階段中都受到Hedgehog蛋白影響，并可以促進BMSCs向成骨分化增殖（BMSCs主要依靠Runx2因子向成骨前體細胞分化，進一步促進Osx因子分化為成熟的成骨細胞）［15］。最后，PPARγ是促進BMSCs成脂分化的關鍵轉錄因子，同時也能負反饋于Runx2，而抑制骨形成［16-17］。C/EBPα也可以在PPARγ的輔助下用來評估BMSCs成脂分化情況［18］。骨代謝過程中涉及到眾多生長因子，骨吸收和骨形成過程在不斷地進行，不同生長因子在不同階段的成骨過程中發揮著不同作用，在促進成骨細胞增殖、成骨及骨吸收等方面作用顯著。然而，目前Hedgehog信號通路在OP中的作用機制尚未完全明確，仍然需要繼續探究，進一步挖掘補腎中藥基于Hedgehog信號通路靶向治療OP等骨代謝疾病的潛力。

2 中藥調控Hedgehog通路治療OP的研究

2.1 單味中藥 近年對于中藥有效成分的研究進展迅猛，已進入分子水平。補腎中藥的有效成分能調節骨吸收與骨形成的平衡，使骨形成大于骨吸收，而延緩或防止OP的發生。

2.1.1 杜仲 杜仲在我國已有超過兩千年的應用歷史，并出現于眾多經典方劑。《神農本草經》記載：“主腰脊痛，益精氣，強筋骨。”《日華子本草》中記載杜仲具有“治腎勞，腰脊攣”的作用。現代藥理研究表明，杜仲提取物中主要的活性物質有木質素類和環烯醚萜類，其水、醇提物和藥物血清能促進成骨細胞增殖分化，促進骨重建，改善骨代謝紊亂，防止OP的發生［19］。堿性磷酸酶、骨鈣素、骨保護素及Ⅰ型前膠原C-端前肽/N-端前肽為骨形成的標識，對成骨細胞的活性有很好的反映作用［20］。HA等［21］通過杜仲皮活性成分干預小鼠骨髓細胞來研究其對成骨細胞的增殖作用及對破骨細胞的抑制作用，發現其部分提取物甲醇提取物、三氯甲烷等可誘導釋放生長激素，從而促進成骨細胞的增殖，少數成分對破骨細胞有抑制作用，由此促進骨重建。研究發現，杜仲通過影響PTH、RUNX2、PPAR等因子的表達調控BMSCs分化，促進骨穩態的平衡，治療OP［22］。其中，Runx2屬于Runt基因家族中的重要轉錄因子，聯結成骨細胞后可以激活骨鈣蛋白、骨橋素等影響成骨細胞分化和骨重建，骨代謝達到最佳平衡狀態［23］。Hedgehog通路中多個階段有Runx2的參與，并且其蛋白的表達在各階段受Hedgehog蛋白影響。

2.1.2 補骨脂 補骨脂作為補腎壯陽類中藥廣泛應用于骨科臨床實踐中。《藥性論》記載補骨脂有補腎壯陽強骨的功效。《方外奇方》云：“……元陽堅固，骨髓充實，澀以治脫。”現代藥理學研究發現，該藥主要活性成分為類黃酮、香豆素及萜類酚類化合物［24］。補骨脂素是香豆素中活性成分，韓宇等［25］通過給大鼠灌服補骨脂素制劑，配制含藥血清并用之干預大鼠BMSCs，用酶聯免疫吸附法檢測大鼠BMSCs中堿性磷酸酶蛋白含量，實時定量PCR法檢測Shh、Ptch1、Gli1 mRNA及蛋白表達。結果發現，補骨脂素能減弱Ptch1 mRNA及蛋白表達，提升Shh、Gli1 mRNA及蛋白的表達。Ptch1屬于Ptc，是Hedgehog通路轉錄過程中的重要因子，Shh是通路中關鍵啟動蛋白。Gli1刺激下游轉錄基因而活化Hedgehog通路，使大鼠BMSCs向成骨分化，為轉錄過程中的激化因子。Ptch1與Shh結合消除了Ptc對Smo活性的抑制，誘導下游轉錄基因的表達，使Hedgehog通路正常發揮作用，以調控骨密度。Shh促進骨礦化，促進堿性磷酸酶活性及表達，也可誘導Gli1表達而增強成骨細胞增殖。補骨脂能通過調控Hedgehog通路中Shh、Ptch1、Gli1 mRNA及蛋白的表達促進BMSCs成骨分化，維持骨代謝平衡，提高骨密度，防治OP。

2.1.3 淫羊藿 淫羊藿很早被廣泛應用于治療OP的復方中，近年來對其作用機制的研究越來越深入。《玉楸藥解》記載味辛、苦，微溫，入肝、腎經，有榮筋強骨之功。《本草備要》言：“補命門，益精氣，堅筋骨。”該藥活性成分主要為淫羊藿總黃酮（TFE），TFE通過多種信號通路促進成骨細胞分化，從而在OP的治療中發揮作用［26］。Hedgehog蛋白在多個階段影響Runx2和Osx的表達，以促進BMSCs分化，TFE可能通過激活該信號通路中的特定靶基因增強Runx2和Osx的表達，最終發揮治療OP的作用。目前，對于TFE在Hedgehog信號通路上的具體靶點基因的研究極為少見。TFE的主要活性成分為淫羊藿苷（ICA），ICA能溫腎補脾，是一類活性程度較高的多酚類物質，能夠很好地提高骨質的重構率，抑制骨吸收，從而提高骨密度和骨質量，并對OP起到很好的防治作用［27］。ICA可以在骨重建過程中影響多種骨骼細胞的功能，以達到增強骨質，防治OP的作用，如ICA促進BMSCs向成骨細胞分化［28］。

2.2 中藥復方 “腎主骨”理論在OP的防治上展現出中醫獨有的特色和優勢。人體骨骼的變化是腎中精氣盛衰的外在體現，人體骨骼只有在腎精的滋養下才能正常生長并保持堅固，腎中精氣虧損，骨骼無以充養而失堅固［29］。補腎填精類中藥復方很早便應用于臨床對慢性骨代謝性疾病的治療，特別是對OP的預防和治療，具有良好的臨床效果。中藥復方則通過激活Hedgehog通路中的Shh、Gli1蛋白，從而控制下游基因的表達，以促使新骨生成，抑制骨骼吸收，達到預防OP的效果。

在補腎填精中藥復方左歸丸治療OP的實驗研究中，通過去除大鼠雙側卵巢建立絕經后OP模型，給予中藥復方左歸丸灌服，發現大鼠股骨和腎組織中Ptch1和Gli3 mRNA表達及其蛋白含量顯著降低，股骨骨密度升高［11］。中藥復方左歸丸通過下調PTCH1和Gli3 mRNA表達，促進Hedgehog信號通路中下游靶點基因轉錄，促進骨形成，以提高骨密度。說明補腎填精中藥復方左歸丸能有效提高骨密度，具有防治OP的作用。在右歸丸治療OP的研究中，體外分離培養大鼠BMSCs，給予大鼠灌服右歸丸，制備含藥血清，實驗組細胞培養液中混合含藥血清連續培養15 d，酶聯免疫吸附法檢測出大鼠BMSCs中Shh、Ptc、Gli1含量均升高，表明右歸丸可能通過調控Hedgehog通路中某些特定基因來影響OP發展過程［30］。研究發現，右歸丸通過上調大鼠BMSCs中Shh含量，活化Hedgehog通路，Shh也可以促進Gli1及Ptc轉錄，進一步加快Hedgehog通路的轉錄過程，促使BMSCs向成骨分化。這可能是中藥復方右歸丸在預防治療OP中的重要機制。梁學振等［31］采用培養液混合補腎活血膠囊含藥血清干預大鼠股骨BMSCs，藥物介導Shh和Gli1活化Hedgehog信號通路，以上調Runx2、Col1a1兩個因子的表達，推動大鼠BMSCs向成骨分化；下調PPARγ、C/EBPα兩個因子的表達，抑制大鼠BMSCs的成脂分化，繼而調控大鼠BMSCs成骨與成脂分化之間的平衡，以加快新骨生成。

3 小 結

中醫學認為，OP的基本病機為肝腎虧虛、氣滯血瘀，并通過應用補腎強骨、活血化瘀類中藥取得了良好的臨床效果。對OP病理分子機制的深入研究更加明確藥物作用的信號通路及靶點，為中醫防治OP提供基礎研究和臨床治療的理論依據。在分子機制及信號通路層面研究發現，中藥活性提取物通過對Wnt、OPG/RANK/RANKL、MAPKs、PI3K/Akt、BMPs、GABA、Hedgehog等多條信號通路中一條或多條通路的交叉調控，激活或抑制相關靶點基因，從而促進成骨功能或抑制破骨功能［13］，以達到骨代謝的最佳平衡，發揮抗OP的作用。本綜述通過總結影響OP骨代謝的Hedgehog信號通路的某些補腎中藥及復方的作用機制，認為中藥對OP的干預過程可以做到一藥多通路，一藥多靶點來精準、有效地發揮調控作用。中藥復方以君、臣、佐、使多元用藥的方式相互輔助，又相互制約，從多通路、多靶點交叉調控影響成骨過程。

目前對于中藥活性成分防治OP在信號通路層面的機制研究還存在局限，首先，中醫用藥是在中醫基礎理論、中醫辨證論治的指導下進行的，而單純的藥理學研究并沒有結合中醫理論及辨證，只是分析藥物中活性成分的作用。如果在藥理學研究過程中結合中醫理論及辨證，可能會對于中西醫結合用藥更有價值。其次，目前中藥信號通路大多是基于一藥一通路的研究，中藥復方以多藥多通路交叉調控為主，因此，對中醫臨床應用的研究要以中藥調控不同通路之間的聯系以及各通路之間是否有促進或抑制作用為主。此外，對于Hedgehog等保守信號通路的研究較少，缺少相關中藥對其影響的實驗研究，未來可以進一步深入研究保守通路作用機制及是否對其他相關通路有促進或抑制作用，以便于指導臨床中醫用藥。

綜上所述，補腎中藥作用于Hedgehog信號通路在防治OP的發生中有重要的意義，對于臨床中醫用藥有很好的指導意義。隨著現代實驗研究方式的不斷創新，并不斷融入中醫理論及辨證論治的理念，不斷突破中藥對于分子機制和信號通路影響的研究，更加合理地指導OP在臨床實踐中的用藥，OP的中藥治療將有重大突破。

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收稿日期：2022-12-05；修回日期：2023-01-27

基金項目：2021年甘肅省財政轉移支付地方項目（20210140305）；蘭州市科技計劃項目（2022-3-30）

作者單位：1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

通信作者：鄧強