血液透析、腹膜透析患者預后與腸道菌群的相關性分析

張 紅,丁涵露,2,陳 瑾,2

(1.西南醫科大學附屬醫院臨床醫學院,四川 瀘州 646000;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院,四川 成都 610072)

慢性腎臟病是指多種原因導致的慢性腎臟結構和功能障礙(腎臟損害病史大于3個月),其中包括腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)正常和不正常的病理損傷、血液或尿液成分異常,及影像學檢查異常,或不明原因GFR<60 ml/min·1.73m2超過3個月。中國慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患病率為10.8%[1]。CKD 5期的患者采用腎臟替代治療,但研究表明,在治療期間依然存在毒素潴留的問題[2]。腸道菌群是一個具有營養和保護功能的動態共生生態系統,與宿主的代謝系統保持著持續的相互作用。病理情況下,腸道菌群的失衡,某些細菌過度生長,慢性激活免疫系統,從而引發疾病[3.4]。透析患者和健康對照組的腸道菌群在組成和功能存在差異,然而這些結果并不一致[5-8]。本研究比較了血液透析(hemodialysis,HD)、腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者和健康對照者的腸道菌群差異,并進行了腸道菌群與透析患者預后相關性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2005年1月至2022年6月在四川省人民醫院隨訪的患者63例。納入標準:在四川省人民醫院隨訪的HD及PD患者,治療時間大于3個月。排除標準:①合并惡性腫瘤、肝硬化、腸手術、腸易激綜合征的患者;②標本采集前1周使用益生菌、益生元或抗生素;③孕婦或腎移植受者;④素食者或純素食者的患者。本研究經我院倫理委員會審核通過(編號:2018195),并由患者簽署臨床標本收集檢測知情同意書。依據患者的治療模式分為PD組27例、HD組36例。對照組為2018年6月至2022年6月于四川省人民醫院體檢中心體檢的健康人群57例。所有患者隨訪至2022年6月或患者死亡或失訪結束。

1.2 方法

1.2.1一般資料采集 收集患者人口學資料,包括開始腹透時的年齡、性別、CKD的原因。血紅蛋白、血漿白蛋白、尿素、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、膽固醇、估算腎小球濾過率。

1.2.2糞便樣本收集 在糞便標本采集前7天,禁止使用益生菌或食用酸奶。保持糞便中部均勻部分約1克,避免食物殘留。將糞便收集到收集管中,4小時內放入-80 ℃冰箱中。女性避免進行生理周期取樣。

1.2.3腸道菌群檢測 對DNA樣本進行定量,并選擇16S rRNA的V3-V4高變區進行PCR擴增。使用Trimmomatic(v 0.36)得到原始數據,然后用FLASH軟件(v1.2.11)拼接雙端序列,要求序列重疊至少10 bp,采用滑動窗口法對序列做質量過濾,去除接頭污染和低質量數據,將重疊的成對端讀數合并到標簽中(標簽與OTU的序列相似性為97%),使用核糖體數據庫給OTU代表序列分配分類等級。最后,基于OTU和分類等級進行α多樣性、β多樣性以及不同物種的篩選進行了分析。

1.3 統計學方法使用SPSS 26.0統計軟件包進行數據分析。正態分布計量資料用均數±標準差表示,偏態分布計量數據以中位數(四分位間距)表示,三組以上比較采用ANOVA檢驗,多重檢驗采用Bonferroni分析。采用非參數檢驗(Mann WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis) 對非正態分布的參數進行分析。計數資料以百分率表示,比較采用卡方檢驗。P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組臨床資料比較HD組共36例(其中死亡2例,失訪3例),男18例,女18例,年齡(53.89±14.08)歲;PD組27例(其中死亡2例,失訪1例,5例轉為腎移植,6例轉為HD),男19例,女8例,年齡(52.26±14.29)歲;57例為健康對照組,男31例,女26例,年齡(54.89±5.33)歲,3組患者年齡、性別比較差異無統計學意義(均P>0.05),而HD與PD組的血肌酐、血尿素氮、血尿酸值顯著升高(均P<0.001)。對照組的BMI、膽固醇高于HD組與PD組(P<0.05)。PD組的甘油三酯高于HD組及對照組(P=0.008)。見表1。

表1 PD組、HD組與對照組的一般資料比較

2.2 腸道菌群類別分析如圖1所示,不同顏色代表不同組,每個圓圈內的數字表示各組中的OTU數量,重疊區域表示各組中的共同OTU集合。三組所共有的OTU數為645,血透組、腹透組、對照組的OTU數分別為916、727、1405,其中透析組的OTU數明顯低于對照組,腹透組與血透組之間差距不大PCA構建二維圖(圖2),顯示血透組及腹透組與對照組之間距離較遠,第一主成分的貢獻為12.04%,第二主成分的貢獻為8.98%。

圖1 不同組別之間的Venn圖

圖2 不同組別OTU豐度的主成分分析

2.3 組及組間α多樣性分析健康對照組與透析患者相比,Sobs、Chao、Ace、Shannon指數顯著升高,差異有統計學意義(P均小于0.05)。說明健康對照組的群落均勻性和物種的多樣更高,而PD組與HD組的物種豐度無明顯差異。見表2。

2.4 各組腸道菌群多樣性及門、屬水平的分類分布根據不同分類等級(門、綱、目、科、屬)的物種組成比例情況可以看出,從門水平上看(圖3),各組主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭狀菌門組成,其中對照組還有一定比例的放線菌門,血透組中存在一定量的疣微菌門。在屬水平上(圖4),對照組中的雙歧桿菌、普雷沃特拉菌與另外兩組比較增多,擬桿菌屬減少。HD組的糞球菌屬和普雷沃特拉菌低于對照組、PD組,擬桿菌屬增高。PD組的瘤胃球菌屬增高。

圖4 各組在屬水平上的相對豐度

2.5 腸道菌群與預后相關性分析通過顯著性分析發現,HD組中2例死亡病例普雷沃特拉菌減少。PD組中2例死亡,其在門水平主要為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門,屬水平上薩特氏菌、瘤胃球菌屬增高,普雷沃特拉菌、埃希菌屬、土里西桿菌減少。危險因素分析顯示普雷沃特拉菌是影響透析患者預后死亡的危險因素(P=0.047)。見表3。Spearman相關性分析顯示普雷沃特拉菌與患者生存時間負相關性(r=-4.18,P=0.001)。

表3 影響透析患者預后的危險因素分析

3 討論

HD和PD都能去除體內多余的水分以減少容量負荷,清除代謝廢物(如肌酐、尿素氮和其他小分子毒素),并維持電解質和酸堿平衡。這些都是影響腸道微生物的因素。但是,幾乎沒有研究證明HD和PD患者腸道微生物區系的影響。本研究比較了PD和HD患者與健康對照者腸道菌群差異,并且分析了與PD和HD組患者預后相關的腸道菌群。

研究觀察到門水平上各組主要由擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭狀菌門組成。對照組的放線菌門升高,HD、PD患者的擬桿菌門增高。屬水平上,對照組中的雙歧桿菌、擬桿菌屬、普雷沃特拉菌增多,HD組中的小桿菌屬、糞球菌屬減少。PD組中死亡的2例薩特氏菌、瘤胃球菌屬增高,普雷沃特拉菌、埃希菌屬、土里西桿菌減少;轉為血液透析的6例患者考拉桿菌屬、鏈球菌屬增高,土里西桿菌減少。HD組中死亡的2例優桿菌屬、鏈球菌屬增高,普雷沃特拉菌、顫螺菌屬、土里西桿菌減少。

CKD患者腸道微生態腸道菌群失調常表現為菌群種類、相對豐度及其代謝產物改變[8]。目前已經有許多研究將腸道菌群變化與CKD的發病機制聯系起來。終末期腎病患者尿毒癥毒素聚集,腸道環境改變,腸道中普氏桿菌減少,擬桿菌增多[9]。這與本研究結果相似。血液透析在超濾過程中維持血流動力學穩定的代償機制下內臟血流量的減少可能會導致腸道低灌注,從而破壞腸道屏障,增加細菌易位的風險。Wang等發現CKD5期的患者腸道內雙歧桿菌減少,慢型埃格特氏菌增多[10]。另一項對73名受試者進行的臨床研究發現,CKD患者和對照組之間存在31個系統類型的差異[11]。研究顯示與非透析的CKD患者相比,HD可以改善腸道微生物區系紊亂,包括增加雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌,減少大腸桿菌和糞腸球菌[5]。Luo等的研究發現PD對CKD患者腸道菌群沒有顯著影響[6]。相比之下,Hu等的研究比較了PD、HD、非透析CKD和健康對照組的腸道微生物區系,并報道了PD降低了微生物多樣[7]。此外,本研究觀察到各組的梭狀菌門有所升高。腸道微生物群受到不同環境、飲食和生活習慣的影響,并且受到患者依從性的影響,這可能解釋產生差異的原因。

本研究表明普雷沃特拉菌與患者生存呈現負相關。由于培養的局限性,普雷沃特拉菌與其他屬相比受到的關注較少。普雷沃特拉菌屬于革蘭氏陰性厭氧菌,是口腔中最具優勢的屬之一,同時也在人類的皮膚、陰道和胃腸道中被發現。其與多種疾病有關,包括炎癥性自身免疫性疾病、機會性感染、細菌性陰道病以及口腔生物膜形成和疾病。相反,另一項研究發現普雷沃特拉菌與胰島素抵抗有關,而較低基線水平的普雷沃特拉菌與超重個體在地中海飲食干預后胰島素抵抗的降低有關[12]。感染中最常見的是口腔感染,報告最多的是牙周感染和牙髓感染,肌肉骨骼、頭頸部、下呼吸道和皮膚感染少見,此外,口腔感染也可能導致繼發性全身感染或與器官相關的感染[13]。研究表明,在關節炎小鼠中普雷沃特拉菌通過擴大腸屬Allobaculum、增加丁酸鹽產量來預防關節炎[14]。除此之外,普雷沃特拉菌可通過調控宿主NF-κB/C-myc影響育齡婦女持續人類乳頭瘤病毒感染和宮頸病變的發生[15]。在克羅恩病和潰瘍性結腸炎患者中,普雷沃特拉菌和產黑素假單胞菌的豐度顯著增加,因此普雷沃特拉菌被認為是與克羅恩病相關的一個潛在標志[16]。Yang等的研究發現普氏外膜蛋白負責Th17的發展、激活以及IL-17B和IL-17A的表達,最終促進肺纖維化, 這些結果表明共生普氏桿菌不僅加重了呼吸道免疫反應,而且能夠調節病原誘導的免疫反應[17]。目前普雷沃特拉菌在慢性腎臟病中的作用機制尚不明確。

本研究的優勢為觀察了腸道菌群與CKD患者的預后關系,反映了四川地區CKD患者的腸道菌群變化。本研究尚存在有一定的局限性:首先,它是一個有地域限制的單中心研究。其次,本研究在樣本收集時是依據患者自愿入組的原則,沒有進行隨機分組。但本研究顯示了不同透析治療模式的CKD患者腸道微生物多樣性和群落變化,發現了腸道菌群變化與患者生存的相關性。在此基礎上,我們將針對普氏菌屬與CKD的關系深入研究,為通過調節腸道菌群防治CKD的治療提供依據。