細菌性肺炎患者呼出氣與細菌培養頂空氣體光聲光譜的對比分析

劉靜莎，張健鵬

（1.北京市順義區醫院重癥醫學科，北京 101300 ；2.中國人民解放軍總醫院第三醫學中心呼吸科，北京 100039）

自1971 年Pauling 等[1]發現人呼出氣體中存在著極微量的揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）以來，相關的基礎研究顯示，呼出氣VOCs 可能對一些疾病的早期診斷具有價值。人體內的VOCs 是在人體組織的正常生理過程及與疾病相關的病理過程中產生的[2]，是體內代謝過程的降解產物，可以通過呼出氣獲得，其成分直接因病理過程（如感染或惡性腫瘤）而發生改變[3]。VOCs 譜的變化可能反映了整個身體或特定組織的代謝紊亂[4]。近年來，VOCs 已經顯示出作為各種疾病生物標志物的巨大潛力[5]，VOCs 的使用已被提議作為一種快速、潛在低成本和非侵入性的方法來診斷多種疾病。本研究擬采用光聲光譜技術（Photoacoustic spectroscopy，PAS）進行檢測，觀察比較細菌性肺炎患者的呼出氣與同種細菌頂空氣體VOCs 光聲光譜圖之間的差異，以評價細菌性肺炎患者的呼出氣對同種致病細菌是否具有代表性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

肺炎組：隨機選擇2021 年1 月至2022 年1 月期間在某三甲醫院住院的痰細菌培養陽性的肺炎患者20例，其中大腸桿菌感染性肺炎4 例，肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎8 例，銅綠假單胞菌感染性肺炎8 例。納入標準：（1）年齡18 ～80 歲，性別不限；（2）確診細菌性肺炎；（3）連續三次痰細菌培養發現同一種致病菌；（4）無吸煙史，無循環系統疾病、消化系統疾病、糖尿病、腎功能不全等；（5）對研究知情同意。排除標準：（1）合并其他系統疾病；（2）需要進行有創或無創通氣；（3）存在通氣或換氣功能障礙；（4）無法配合正確收集呼出氣體。細菌組：選取大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌三種細菌為研究對象，這三種細菌均通過對上述患者進行痰細菌培養分離得到，對致病菌進行傳代接種，得到單純致病菌株。

1.2 實驗器材

1.2.1 光聲光譜分析儀（型號：PASTA- 10001）由中國航天科技集團某研究所提供，儀器主要參數：采樣容積：30 mL；檢測時間：30 min；檢測精密度：PPb 級；工作適宜溫度：0℃～40 ℃。該儀器測量結果的穩定性較好，不會因為環境溫度和氣壓的變化而產生漂移。

1.2.2 培養儀器 Tedlar 氣體采樣袋（圖1）及外接一次性吹嘴，購于大連德霖氣體包裝有限公司。Tedlar氣體采樣袋容量為300 mL，反復利用時需用純氧氣進行反復充氣和抽氣，并在60 ℃條件下老化4 h（經過老化后的采樣袋能有效降低背景值，可以再次使用）。增菌培養基（哥倫比亞型）購于賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司。雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶為實驗小組自行設計制作（圖2）。恒溫恒濕培養箱由北京中西遠大科技有限公司提供，產品參數：型號：TH70-HWS-350；控溫范圍：5℃～50 ℃；溫度波動度：±0.5 ℃。

圖1 Tedlar 氣體采樣袋

圖2 雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶

1.3 方法

1.3.1 氣體收集 （1）肺炎組呼出氣收集：①Tedlar采樣袋第一次使用時用蒸餾水清洗，烘干，去除殘留物，以后重復使用時用純氧氣進行反復充氣和抽氣3次，以置換殘留氣體，備用。②受試者晨起空腹安靜狀態，在通風良好的室內平靜呼吸0.5 h，用清水進行口腔清潔后待測。③連接一次性吹嘴，打開夾子，囑患者向Tedlar 采樣袋中吹氣，反復呼吸數次，盡量使袋內氣體接近肺泡氣體濃度。④關閉夾子，10 min內連接光聲光譜儀進行檢測。（2）細菌頂空氣體收集：將三種目標細菌接種到增菌培養基（哥倫比亞型）平板中，將培養基放至雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶中，放于35 ℃恒溫恒濕培養箱中培養24 h 得到細菌頂空氣體。

1.3.2 氣體光聲光譜檢測 肺炎組：將收集好呼出氣且處于夾閉狀態的Tedlar 氣體采樣袋的出口端用橡膠管與PASTA1001 進氣閥管連接，然后運行機器抽氣1 min，形成管道負壓（此時池壓為233 mBar）。打開橡膠管抽氣，當儀器顯示壓力平衡后運行機器，開始檢測，分別獲得初始實驗數據和初始光譜曲線（橫坐標X 值表示波數，單位為cm-1，縱坐標Y 值表示幅值，單位為au），本研究選擇檢測波數范圍為1000 ～1250 cm-1，因為此波數段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機揮發性化合物，且幅值與所測揮發性化合物的濃度成正比。細菌組：將取樣瓶上端的橡膠管（止血鉗夾閉狀態）與光聲光譜分析儀的進氣閥連接，打開進氣口橡膠管上的止血鉗，對取樣瓶中的頂空氣體進行抽氣檢測，獲得初始實驗數據。重復上述方法檢測其他取樣瓶中的氣體實驗數據。

1.4 數據分析

本實驗采用Originpro 8.5 繪圖軟件對初始實驗數據進行分析，合成光聲光譜圖（X 值表示波數cm-1，Y 值表示幅值au），選擇檢測的波數范圍為1000 ～1250 cm-1，因為此波數段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機揮發性化合物，其中幅值與所測揮發性化合物的濃度成正比。

2 結果

2.1 大腸桿菌培養頂空氣體（細菌培養大腸）與大腸桿菌感染性肺炎（大腸）患者呼出氣的光聲光譜檢測結果

如圖3 所示，在增菌培養基培養24 h 的大腸桿菌頂空氣體的光聲光譜檢測結果顯示：1236 ～1238波 數 段、1228 ～1232 波 數 段、1120 ～1126 波 數段：大腸桿菌頂空氣體均出現了與大腸桿菌感染性肺炎患者相似的波峰。同時發現，大腸桿菌培養頂空氣體的光聲光譜結果在1120 ～1126 波數段的波峰與大腸桿菌感染性肺炎患者呼出氣產生的波峰形態不完全相同，似乎右側又有一個小峰，使該峰變成雙峰，但可能因濃度較低，不能完全形成波峰。另外，大腸桿菌細菌培養頂空氣體的光聲光譜檢測結果在1120 ～1126 波數段呈現的波峰形態相同，但患者呼出氣檢測結果卻呈現出多樣化改變。

圖3 大腸桿菌感染性肺炎患者呼出氣與相應細菌培養頂空氣體檢測結果的比較

2.2 肺炎克雷伯桿菌頂空氣體與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣的光聲光譜檢測結果

如圖4 所示，在增菌培養基培養24 h 的肺炎克雷伯桿菌頂空氣體的光聲光譜檢測結果中發現：（1）1240 ～1242 波數段：出現與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣中相似的波峰，但波峰不明顯，幅度存在差異；（2）1236 ～1238 波數段：并未出現與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣相應的波峰。另外，我們發現肺炎克雷伯桿菌細菌培養所得到的頂空氣體光聲光譜檢測結果中在1240 ～1242 波數段產生的波峰均較平坦，而肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者的呼出氣在此波數段產生的波峰較尖銳，相似但不完全相同。

圖4 肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣與相應細菌培養頂空氣體檢測結果的比較

2.3 銅綠假單胞菌頂空氣體與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者呼出氣的光聲光譜檢測結果

如圖5 所示，在增菌培養基培養24 h 的銅綠假單胞菌頂空氣體的光聲光譜檢測譜線中發現：（1）1214 ～1216 波數段：并未出現與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者相似的波峰，曲線較平坦；（2）1228 ～1232 波數段：出現了與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者相似的波峰。

圖5 銅綠假單胞菌感染性肺炎患者呼出氣與相應細菌培養頂空氣體檢測結果的比較

3 討論

臨床實踐中對于下呼吸道感染的患者，尤其是急危重癥患者，及早明確感染的病原菌極其重要，可影響患者的救治時機，甚至會直接影響患者的預后和病死率。另外，隨著臨床抗菌藥物的廣泛應用，感染性疾病患者中耐藥菌株的種類和數量逐年增加。因此，準確檢測病原微生物有助于臨床制定精準的治療方案，防止抗生素的濫用，同時也減低了患者的平均住院時間和平均住院費用，減輕了患者家庭的負擔。目前，臨床上常用的檢測病原菌的方法有微生物分離培養、抗原檢測、血清學抗體檢測、常規病原學核酸檢測等。其中微生物分離培養被認為是病原學檢測的金標準，但培養時間長，周期通常在2 ～14 d 左右，最長可達21 d，易影響患者的及時救治。另外，微生物分離培養的條件要求高、易失敗、混雜因素多，且敏感性較低，并不利于疾病的早期診斷。抗原檢測是通過檢測病原體表面的糖蛋白抗原物質來判斷機體感染何種病原體，可用于早期的快速病原診斷。但抗原檢測易受到采樣限制，病原體濃度低時，敏感度相對較差，且檢測陰性并不能排除感染。抗體檢測因免疫窗口期較長，不能用于急性感染的病原學診斷。常規病原學核酸檢測的敏感度和特異性高，不受抗菌藥物應用的影響，無免疫窗口期，但因氣溶膠污染可能造成假陽性，部分病毒陽性不能確定現癥感染的問題。因此，針對下呼吸道感染，探索一種無創、準確率高、及時快速、敏感度高、符合臨床實際的快速病原學檢測方法非常必要。近年來，VOCs 檢測技術的蓬勃發展，無疑為解決這個問題指明了新的方向。

在醫療領域，人體呼出氣中的多種氣體都可以作為醫療診斷的生物標志物[6]。如呼出氣一氧化氮檢測被臨床呼吸科廣泛應用于檢測氣道炎癥的性質和程度，協助支氣管哮喘的診治，評估肺癌患者的氣道炎癥等，已然是一種極為成熟的檢測技術。目前，檢測VOCs 的方法主要有氣相色譜法、質譜法、光譜吸收檢測法、傳感器或電子鼻法以及PAS 等[7]。氣相色譜法的設備復雜、體積較大且價格昂貴，很難用于現場測量。質譜法對于不能氣化時發生分解的化合物不適用。光譜吸收檢測方法是基于氣體對特定波長光的吸收，通過吸收光譜和光強度的變化來判斷氣體的濃度，易受到光散射的影響。電子鼻是一種能夠模擬動物嗅覺的電子裝置，由三大功能部件組成，分別是氣體采樣器、氣體傳感器陣列和模式識別系統。其工作原理是進入電子鼻的氣體樣品與傳感器發生可逆的物理、化學反應，產生電信號，電信號通過放大、數字轉換進入信號處理系統和模式識別系統，完成對氣體樣品的檢測。目前，關于上述檢測方法的研究均存在著樣本量小、檢測方法復雜、可重復性差、檢測標準和方法不統一、對操作人員要求高等不足，因此，離實際臨床應用尚有較大距離。PAS 是通過測量光聲效應產生的聲波信號，而不是采用直接測量光強度的變化來達到對氣體檢測的目的，其檢測結果與光的散射和透射無關。因此，PAS 是一種無背景信號干擾的間接測量方法，具有靈敏度和選擇性高、容易實現多氣體檢測的優點，使得該技術在多組分氣體檢測方面具有十分廣闊的應用前景。

氣相色譜法的檢測模式是必須事先明確目標氣體成分，之后再檢測該氣體是否存在，所以采用的是“逆推”模式。傳感器和電子鼻法則是先通過氣味傳感器對目標氣體進行初步識別，之后再對整體氣體混合物的生物揮發性特征進行檢測判斷，而后以某種相似的屬性進行重新組合排列，進而區別氣體成分，也就是說采用的是“順比較法”模式。本研究所采用的PAS既可以通過“順比較法”，根據不同細菌揮發性有機化合物所形成的光聲光譜圖之間的差異來辨別病原菌，又可以通過“逆推”模式，進一步驗證目標氣體是否存在[8]。因此，可大大提升靈敏度，且該方法操作簡單、快速、無創且成本低，1 h 左右即可做出準確的診斷，無疑給醫生的臨床決策提供了快速、精準的技術支持。這也是該方法在病原學檢測中的優勢所在。用PAS 檢測VOCs 為病原菌的鑒定提供了一種簡單、快速的方法，有望成為臨床早期病原學檢測的新技術。

本研究通過對細菌性肺炎及同種致病菌培養頂空氣體進行光聲光譜分析發現，大腸桿菌頂空氣體在1120 ～1126 波數段均出現了與大腸桿菌感染性肺炎患者相似的單峰；肺炎克雷伯桿菌頂空氣體在1240 ～1242 波數段出現了與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣中相似的波峰；銅綠假單胞菌頂空氣體在1228 ～1232 波數段也出現了與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者相似的波峰。同時還發現，大腸桿菌培養氣體的光聲光譜結果在1120 ～1126 波數段的波峰與大腸桿菌感染性肺炎患者呼出氣產生的波峰形態又不完全相同，似乎右側又有一個小峰，使該峰變成雙峰，但可能因為濃度較低，不能完全形成波峰。同樣的，肺炎克雷伯桿菌細菌培養所得的頂空氣體光聲光譜檢測結果中在1240 ～1242 波數段產生的波峰均較平坦，而肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者在此波數段產生的波峰較尖銳，二者相似但不完全相同。同一種細菌培養所得的頂空氣體的光聲光譜檢測結果在同一位置出現的波峰相同，但人體感染后的呼出氣在相同位置的波峰卻出現了多樣化，如大腸桿菌感染性肺炎患者的呼出氣在1120 ～1126 波數段有單峰、有雙峰，體現了人體呼出氣混雜因素的多樣性。這充分印證了人體呼出氣中的VOCs 其成分直接因病理過程（如感染或惡性腫瘤）而發生改變[3]。可見，人體是一個復雜多變的整體，加之呼出氣的混雜因素較多，在細菌與機體的相互作用中，細菌單獨培養及人體感染后所產生的代謝產物是否有所變化及具體機制如何，有待于進一步研究明確。此外，由于本研究中的樣本量很小，數據對整體的代表性欠佳，且細菌培養過程中可能出現其他細菌的污染、細菌在不同代謝時間產生的代謝產物不盡相同等多種混雜因素的存在，均可影響實驗數據。因此，未來我們將進一步擴大樣本量，完善實驗方法及檢測技術，使下一步的實驗更加完善，實驗結果更加可靠。