基于分子對接技術分析白術治療2型糖尿病的核心靶點

袁龍飛，李亞輝，楊欣，張文潔，劉彤玲，楊敏，楊美紅

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025）

隨著人們生活水平不斷提高，全球糖尿病發(fā)病率不斷升高，其微血管并發(fā)癥的患者人數(shù)也逐年增加［1］。糖尿病由于機體糖代謝、蛋白質代謝、脂代謝出現(xiàn)紊亂，導致一系列的并發(fā)癥，如心血管系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等［2］。其中2 型糖尿病占總數(shù)的90%以上，中年人以上為高發(fā)人群［3］。典型癥狀為多飲、多食、多尿以及體質量下降，誘發(fā)2 型糖尿病主要原因包括遺傳、環(huán)境和飲食習慣等，2 型糖尿病表現(xiàn)為長期代謝紊亂引起全身器官出現(xiàn)功能衰竭和障礙，嚴重者可引發(fā)內環(huán)境紊亂等［4］。臨床治療方式在于改善患者血脂新陳代謝水平，減輕胰島素抵抗，從而達到增強患者身體素質的效果［5］。

分子對接技術目前已被廣泛應用于單味藥、中藥復方及新藥研發(fā)工作中，用于預測設計的類似物與特定受體的相互作用，在中藥藥效物質、探索中藥的作用機制等方面得到了廣泛應用，且取得了一定的進展［6］。因此，本研究基于分子對接技術，探索白術小分子配體與2 型糖尿病核心靶點結合位點的親和力，篩選出關鍵核心靶點及化學成分，為2 型糖尿病小分子抑制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫與軟件

本研究選擇的數(shù)據(jù)庫和軟件如下：Cytoscape 3.5.1（http：//www.cytoscape.org）；STRING（https：//string－db.org/）；R（https：//www.r－project.org）；GEO（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）。

2 實驗方法

2.1 2型糖尿病GEO數(shù)據(jù)下載

Gene Expression Omnibus（GEO）是一個公共存儲庫，基于GEO 數(shù)據(jù)庫檢索“type－2 Diabetes mellitus”樣本。可獲得2型糖尿病的芯片數(shù)據(jù)。納入標準：樣本應包含2型糖尿病患者（6例）和非糖尿病患者（7例）的表達數(shù)據(jù)，樣本為人組織來源且芯片數(shù)據(jù)類型為基因表達譜［7］。

2.2 2型糖尿病差異基因分析

使用R 語言（https：//www.r－project.org）進行系統(tǒng)分析，對2型糖尿病基因芯片原始數(shù)據(jù)的探針進行注釋和過濾后，基于R語言對原始芯片數(shù)據(jù)進行分析，2型糖尿病患者和非糖尿病患者差異基因識別采用Limma程序包分析。2型糖尿病差異基因篩選條件為：表達量差異在2倍以上或者0.5倍以下，且以P＜0.05為閾值［8］。

2.3 Hub 靶點分析

關鍵基因（Hub gene）是在生物學過程中發(fā)揮至關重要作用的基因，在相關通路中，其他基因的調控往往受到該基因的影響。可以通過共表達或蛋白相互作用構建互作網(wǎng)絡，然后根據(jù)網(wǎng)絡拓撲結構篩選關鍵基因。準備好本次實驗的網(wǎng)絡文件，STRING（https：//string－db.org/）是在線分析蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，基于Cytoscape3.5.1 中的Cytohubba 模塊［9］，網(wǎng)絡界面會展示這些Hub 節(jié)點在網(wǎng)絡中的連接情況，節(jié)點顏色越深代表分值越高。本研究基于最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC），最大團中心性（maximal clique centrality，MCC），節(jié)點連接度（degree），邊緣滲出組件（Edge Percolated Component，EPC），應力（stress）5 種算法輸出前核心靶點，通過韋恩圖輸出交集靶點。

2.4 分子對接分析

白術化合物基于TCMSP 下載化學結構，采用SYBYL 對小分子進行Minimize 能量最小化優(yōu)化，獲得合理構象。采用藥物分子設計模擬SYBYL 2.1.1 軟件的Surflex－Dock 模塊完成分子對接研究［10］，基于形狀相似性和結構相似性進行能量匹配。初始篩選采用標準模式進行對接，修飾后的小分子與靶標蛋白進行半柔性對接。基于Ligand 模式產(chǎn)生活性口袋，優(yōu)化完畢后保存為SFXC 文件作為對接文件，其他參數(shù)均采用SYBYL默認值［11］。

3 實驗結果

3.1 2型糖尿病差異基因分析

通過GEO 數(shù)據(jù)庫查詢2 型糖尿病相關研究并篩選抽提樣本，選擇編號為GSE25724 的基因表達譜數(shù)據(jù)，包含13 張芯片，其中2 型糖尿病樣本6 例，正常樣本7 例。差異表達基因篩選借助R 中的limma 包進行分析，GSE25724 差異基因個638 個，2 型糖尿病前40 個靶點見表1。本文利用R 軟件中的packages（pheatmap）對差異表達基因進行層次聚類分析，輸出前40 個差異表達基因熱圖，綠色代表基因表達水平下降，紅色代表基因表達水平上升，見圖1。

圖1 差異表達基因層次聚類分析

表1 2型糖尿病前40個靶點

3.2 差異基因GO富集分析

40 個差異基因的GO 富集分析結果見表2，發(fā)現(xiàn)40 個靶點參與的生物過程中主要富集于神經(jīng)發(fā)現(xiàn)、細胞分化等過程（P＜0.01）；基因主要定位于分泌顆粒腔、囊泡腔等（P＜0.01）；分子功能主要有細胞因子活性、氧化還原酶活性和受體配體活性等（P＜0.01）。

表2 GO富集分析

3.3 關鍵基因分析

基于Cytohubba 模塊獲得3 個靶點為前蛋白轉化酶枯草溶菌素1（neuroendocrine convertase 1，PCSK1），胰島淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP），骨硬化病相關跨膜蛋 白1（osteopetrosisassociated transmembrane protein 1，OSTM1）。蛋白的三維結構基于PDB 數(shù)據(jù)庫下載，用于分子對接分析，見表3。

表3 關鍵靶點分析

3.4 分子對接分析

Hub 分析發(fā)現(xiàn)PCSK1、MAFB、OSTM1 為核心靶點，基于SYBYL 分析白術與關鍵靶點匹配程度，見表4，Surflex－Dock 的分子對接可靠性和準確性高，每個化合物與靶標蛋白對接后的結果以total score＞5 為閾值，白術55 個化學成分，其中21 個化學成分與PCSK1 有較好的結合（total score＞5），2 個化學成分與PCSK1 有強烈的結合（total score＞7）；33 個化學成分與IAPP 有較好的結合（total score＞5），5 個化學成分與IAPP 有強烈的結合（total score＞7）；21 個化學成分與OSTM1有較好的結合（total score＞5），4個化學成分與OSTM1有強烈的結合（total score＞7）。通過交集分析發(fā)現(xiàn)白術12 個化學成分均能與PCSK1、IAPP 和OSTM1有較好的結合。

表4 化學成分與關鍵蛋白分子對接

4 討論

白術為臨床常用中藥，具有補脾健胃、燥濕利水、止汗和安胎等功效，化學成分復雜。白術的有效成分為揮發(fā)油、白術內酯類成分、多糖、多炔類化合物、氨基酸和倍半萜類化合物等［12-13］，絕大多數(shù)為單萜或倍半萜類成分，具有改善糖代謝，改善胃腸道功能和調節(jié)腸道菌群等多重藥理作用，對免疫力低下、糖尿病、類風濕關節(jié)炎等疾病具有潛在的治療作用［14-16］。通過分子對接分析發(fā)現(xiàn)白術12 個化學成分均能與前蛋白轉化酶枯草溶菌素1（neuroendocrine convertase 1，PCSK1），胰島淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP），骨硬化病相關跨膜蛋白1（osteopetrosisassociated transmembrane protein 1，OSTM1）有較好的結合。PCSK9是前蛋白轉化酶家族的第9個成員，在肝臟、腎臟等臟器組織中表達，且存在血液中，已經(jīng)研究表明PCSK9 在胰島素抵抗、糖代謝、膽固醇代謝、心肌梗死中發(fā)揮重要作用，參與了糖尿病、膽固醇、肥胖等疾病的發(fā)生和發(fā)展［17-19］。研究者也致力于開發(fā)PCSK9 抑制劑；OSTM1是一種與骨硬化癥相關的蛋白，輔助氯離子通道發(fā)揮其生理作用；已經(jīng)有研究表明人類胰島淀粉樣多肽（hIAPP）是引起β細胞凋亡的重要原因［19-21］。白術與PCSK1、IAPP 和OSTM1 有較好的結合，能否篩選出小分子抑制劑，有待于進一步體內分析。