苗藥“桿努盡煙”對慢性支氣管炎大鼠肺組織AP-1因子表達的影響

劉彥吉 蒙光敏 李貴雪 吳 寧 吳遵秋

貴州醫科大學基礎醫學院，貴州貴陽 550025

慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）又稱慢支，是氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，可定義為在2 年內發生持續超過3 個月的慢性咳嗽咳痰。CB 與吸煙具有很強的因果關系，常可進展為慢性阻塞性肺疾病、慢性肺源性心臟病等嚴重隱患，引發國內外學者的關注[1-2]。貴州省少數民族苗藥“桿努盡煙”（學名吊石苣苔，Lysionotus pauciflorus）常被當地用于治療支氣管炎、肺結核等多種疾病，療效顯著[3-4]，前期科研工作已證實苗藥“桿努盡煙”對CB 大鼠的抗感染治療有一定效果，但作用機制尚不明確[5-7]。研究發現激活蛋白-1（activating protein-1，AP-1）作為包含c-jun、c-fos 亞基的異二聚體復合物，與炎癥性疾病的發病進展有密切關系，是多種疾病的主要靶點[8-10]。當機體受到某些刺激后，可誘導AP-1活化，活化的AP-1 還能促進多種炎癥因子、趨化因子的表達，影響炎癥的發生進展。故本研究通過探究“桿努盡煙”對CB 大鼠抗炎機制及其對AP-1 表達的影響，為苗藥的藥物作用的分子機制的研究提供依據，為后續藥物開發提供實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和藥物 50 只SD 大鼠，體重（200±20）g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，動物合格證號：[SYXF（黔）2018-0001]，本研究經實驗動物倫理委員會審批（審批號：200074）。“桿努盡煙”全草于2014 年6 月采于自我國貴州省凱里市爐山鎮，經貴州中醫藥大學潘爐臺博士鑒定為苦苣苔科（Gesneriaceae）。

1.1.2 藥品、試劑及儀器 遵義牌香煙，桂龍咳喘寧[ 桂龍藥業（安徽）有限公司，國藥準字 Z20053135，規 格：0.5 g×27 粒/ 盒]，脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma），c-jun 抗體（杭州華安生物技術有限公司），c-fos 抗體（南京巴傲得生物科技有限公司），c-jun、c-fos 引物（武漢天一輝遠生物科技有限公司），DNA Ladder（南京諾唯贊生物科技有限公司），DAB 試劑盒（武漢博士德），生物素抗人IL-8 抗體工作液（上海泛柯實業有限公司）、4℃低溫高速離心機（美國Thermo），BX51TPHD-J11 型顯微鏡（日本奧林巴斯），Synergy H1 全功能酶標儀（美國伯騰BioTek），B-500 超微量紫外可見分光光度計（上海元析）等。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 取“桿努盡煙”干樣，使用蒸餾水完全浸泡，后置于90℃恒溫水浴箱中連續浸提，待過濾后收集浸提液，再將藥物濃縮配制濃度2.5 kg/L（按生藥量計），滅菌后放入4℃冰箱儲存。

1.2.2 實驗分組 將50 只大鼠適應性喂養1 周后，按照隨機數表法分成5 組：空白對照組、實驗組（模型組、陽性對照組、“桿努盡煙”高劑量組、“桿努盡煙”低劑量組），每組各10 只。于造模第1、14 天予實驗組各組大鼠LPS 氣管內滴注處理，其余組每日煙熏2 次，每次30 min（4 支遵義牌香煙/箱）。造模檢驗成功后第2 日進行灌胃給藥干預，連續灌胃28 d，1 次/d。28 d 后將各組大鼠處死，解剖提取其肺組織進行后續實驗。見表1。

表1 各組大鼠分組情況

1.2.3 測定指標 取大鼠肺組織，HE 染色，光鏡下觀察病理形態；酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定肺組織腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）水平；蛋白免疫印跡（western-blot）檢測c-jun、c-fos 含量，實時熒光定量PCR 檢測c-jun、c-fos mRNA 表達。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析數據，對各種數據分析實行分級管理。對所有資料都采用正態性和方差齊性檢驗，計量資料用均數±標準差（± s）表示，對滿足正態性分布且方差齊的多組計算均數間比較用單因素方差分析，當方差不齊時，則用非參數秩和檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。P＜ 0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠HE染色結果比較

給藥后肺組織HE 染色。空白對照組：肺臟層胸膜結構正常；肺泡上皮細胞結構正常，未見明顯改變，見圖1A。模型組：各級支氣管周圍和肺泡上皮細胞、肺間質均可見大量的炎癥細胞巨噬細胞、淋巴細胞浸潤，大量纖維組織增生，在局部肺泡上皮細胞產生炎癥壞死病灶，見圖1B。“桿努盡煙”高劑量組、陽性對照組：肺臟層胸膜無結締組織增生；部分支氣管、肺泡上皮細胞有輕度損傷，有少許炎性細胞浸潤，見圖1C、圖1D。“桿努盡煙”低劑量組：肺臟各級支氣管結構正常，部分肺泡上皮細胞已變性壞死，支氣管周圍和肺間質稍有炎性細胞浸潤，可見少許纖維組織增生，見圖1E。

2.2 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-8含量比較

給藥28 d 后，用ELISA 法測定肺組織的TNF-α、IL-8 表達含量，模型組TNF-α、IL-8 表達較空白對照組有明顯提高，差異有統計學意義（P＜ 0.001）。“桿努盡煙”高劑量組和陽性對照組TNF-α 較模型組降低（P＜ 0.01），IL-8 較模型組降低（P＜ 0.001），高劑量組降低最為顯著；低劑量組TNF-α、IL-8 較陽性對照組均稍有增高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。低劑量組大鼠肺組織TNF-α 表達較模型組降低（P＜ 0.05），IL-8 較模型組降低（P＜ 0.01）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-8含量比較（mg/L，± s）

注 與空白對照組比較，aaaP ＜ 0.001；與模型組比較，bP ＜ 0.05，bbP ＜ 0.01，bbbP ＜ 0.001，與陽性對照組相比，cP ＜ 0.05；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-8：白介素-8

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2.3 各組大鼠肺組織中c-jun、c-fos蛋白表達比較

給 藥28 d 后，用western-blot 法 檢 測c-jun、c-fos 表達，與空白對照組比較，各實驗組c-jun、c-fos 表達水平均有增加，其中模型組增加最為明顯（P＜ 0.001）；與模型組比較，“桿努盡煙”高劑量組和陽性對照組c-jun、c-fos 蛋白表達明顯降低（P＜ 0.01），“桿努盡煙”高劑量組c-fos 表達的降低最為顯著；較模型組，“桿努盡煙”低劑量組c-jun 下降明顯（P＜ 0.05），c-fos 表達有所降低（P＜ 0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織c-jun、c-fos 蛋白表達（n=10）

2.4 各組大鼠肺組織c-jun、c-fos mRNA表達

28 d 給藥后，檢測大鼠肺組織c-jun、c-fos mRNA 的表達如圖3 所示，與空白對照組比較，各實驗組大鼠肺組織c-jun、c-fos 的mRNA 表達均有明顯增高，以模型組表達增加更為顯著，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。“桿努盡煙”高劑量組、陽性對照組大鼠肺組織c-jun、c-fos 的mRNA 表達均較模型組明顯下降，差異有統計學意義（P＜ 0.01）；與陽性對照組比較，“桿努盡煙”低劑量組c-jun mRNA 表達增高（P＜ 0.05），c-fos mRNA 有所增高（P＜ 0.01）。

圖3 各組大鼠肺組織c-jun 和c-fos mRNA 蛋白表達（n=10）

3 討論

CB 是常見的呼吸系統慢性炎癥性疾病，主動或被動吸煙以及細菌病毒的反復接觸感染是CB 主要致病因素之一，故采用LPS 聯合煙熏構建CB 大鼠模型。研究顯示“桿努盡煙”的主要有機成分包括黃酮類[11]、苯乙醇類[12]、熊果酸[13]等，均具有較好的抗炎效果。本研究結果顯示，給藥28 d 后，“桿努盡煙”藥物組大鼠一般情況得到明顯改善，炎癥有所好轉，HE 染色結果示，炎癥細胞浸潤情況較模型組明顯減少，這提示“桿努盡煙”對CB 大鼠的治療可能有較好效果，這與胡欣等[5-7，14]前期證實的苗藥“桿努盡煙”對CB 大鼠具有一定的抗炎效果的結果一致。

研究顯示，AP-1 是目前炎癥介導的重要蛋白靶點[15]，其可通過MAPK 信號通路級聯反應[16]激活AP-1 信號，傳導至下游介導炎癥遞質釋放；也可與細胞胞質內同一類型的轉錄因子（transcription factor，TF），如核因子激活的B 細胞的κ-輕鏈增強（nuclear factor kappa-B，NF-κB），通過遠距離機制調節，參與炎癥的介導。CB 的發病機制與炎癥信號通路息息相關，故將AP-1 用作新藥物靶向療法的重點研發對象，可為臨床有效遏制CB 的進展帶來新的診療方向。

本研究造模過程中，存在大鼠因對麻醉藥物過敏而導致死亡的案例，但總體死亡數量不影響實驗結果的統計學意義。給藥28 d 后，檢測大鼠肺組織AP-1 蛋白、轉錄產物mRNA 以及炎癥因子TNF-α、IL-8 的表達情況，結果表明“桿努盡煙”藥物組大鼠上述成分表達量較模型組均顯著降低，因此推測桿努盡煙對可能是通過降低AP-1 蛋白的表達水平，下調下游部分炎性遞質TNF-α、IL-8 等生成，抑制肺組織炎性細胞的過分活化，達到了抗炎治療效果。但本研究并未進一步驗證AP-1 和炎癥因子TNF-α、IL-8 之間具體的相關性表達，以及活化的AP-1 和炎癥因子間表達量的相關性，有待后續實驗進一步證實。

綜上所述，AP-1 可能在CB 的產生進展中起到一定炎癥調節作用，苗藥“桿努盡煙”可通過影響其表達水平，抑制氣道炎癥。