非編碼RNA對晝夜節律調控的研究進展

李海朋 馮瑪莉

山西省中醫藥研究院，山西太原 030000

DNA 中的遺傳信息通過RNA 被傳遞給蛋白質，少數基因組被用于編碼蛋白質，剩余不能編碼蛋白質的轉錄本則被稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[1]。ncRNA 可分為基礎結構型RNA和調控型RNA，本文探討的ncRNA 為調控型RNA。ncRNA 分為長鏈ncRNA（long ncRNA， lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和環狀RNA（circular RNA，circRNA）等。它們參與生物個體的發育與分化、生殖、細胞凋亡和細胞重編程[2]。

隨著人們的壓力越來越大，晝夜節律紊亂，導致與晝夜節律相關疾病，如心臟病、潰瘍等發病率也隨之上升。因此，深入了解晝夜節律運行機制對于疾病預防和有效干預至關重要。本文將從晝夜節律、miRNA、lncRNA 及circRNA 四方面探討ncRNA 對晝夜節律的影響。

1 晝夜節律

晝夜節律是指光敏感生物協調自己的生理和行為，以適應地球時間（24 h）的日常變化[3]。晝夜節律系統主要由兩部分組成：服務時鐘和客戶時鐘。服務時鐘位于下丘腦的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）上，客戶時鐘以互鎖轉錄/翻譯反饋環（translation feedback loop，TTFL）的形式嵌入幾乎每個細胞中。此外細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）作為蛋白質和ncRNA 的重要細胞間載體，攜帶同步信號，并根據服務時鐘校正客戶時鐘[4]。

光刺激通過視網膜向下丘腦傳遞，SCN 直接響應光刺激而重置其時鐘階段。哺乳動物的TTFL 為：蛋白腦和肌肉芳烴受體核轉位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，Bmal1）和晝夜運動輸出周期蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，clock）相互結合形成異源二聚體，復合物與周期蛋白（period homolog，per）、促進隱花色素（cryptochrome homolog，cry）中的E-box 調節元件結合。但per和cry 在表達成熟時，會形成新的蛋白復合物，抑制Bmal1 和clock 活動。當per 和cry 的mRNA 水平下降時，per-cry 復合物降解，開始新的循環，形成生物鐘[5]。除核心回路外，還有兩個子回路，它們與核心回路協同完成振蕩。第一個由視黃酸受體相關的孤兒受體（retinoic acid receptor-related orphan receptor，ROR）和孤兒核激素受體（reverseerythroblastosis，Rev-erb）組成。Rev-erb 和Ror 與Ror 結合元件（retinoic acid receptor-related orphan receptors elements，Rore）競爭性結合，Rev-erb 抑制Bmal1 和clock 的表達，而ROR 反而激活clock和Bmal1。第二個由D-box 相關蛋白組成，包括D-box 結合蛋白（D-box binding protein，DBP）、促甲狀腺激素胚胎因子（thyrotroph embryonic factor，TEF）和肝白血病因子（hepatic leukaemia factor，HLF）。這些蛋白質和核因子與白細胞介素3 調節蛋白（nuclear factor interleukin-3-regulated protein，NFIL3）相互作用[4]。翻譯后進行的磷酸化、乙酰化、糖基化和次酰化等修飾在TTFL 的動力學中同樣起著關鍵作用，尤其是per 和cry 的蛋白的磷酸化對于一個完整的生物鐘周期是不可或缺的[6]。TTFL的轉錄和轉錄反饋循環通路存在于每個細胞中，在組織器官中也存在生物鐘調控模式。

2 miRNA對晝夜節律的影響

miRNA 是由約22 個核苷酸構成的小ncRNA分子，可調控基因表達和作為多種基本細胞過程的關鍵調控因子，如細胞凋亡、分化、增殖等[7]。miRNA 參與晝夜節律調控況情見圖1。

圖1 哺乳動物的TTFL 構成及miRNA 對TTFL 的影響

2.1 對SCN的影響

SCN 接收光信號后與中樞神經系統和非中樞神經系統器官進行通信，將客戶時鐘與環境時間同步[8]。光誘導的miR-132 可減弱重置或夾帶時鐘的能力，它的直接靶標是參與染色質重塑和翻譯控制的基因，這些基因的協調調節是miR-132 依賴性調節per 基因表達和時鐘夾帶的基礎。并證明miR-132/212 的基因消融改變了夾帶的周期和SCN中per2 表達的光周期[9]。與腫瘤相關的miR-17-5p在小鼠的SCN 中有節奏地表達，它的增加和減少均會導致cry1 水平的增加和自由運行期的縮短，miR-17-5p 通過與clock 相互作用，在檢查和穩定生物鐘周期方面發揮重要作用[10]。

神經內分泌通路控制SCN 誘導的外周效應，包括自主神經系統的神經末梢誘導腎上腺素/去甲腎上腺素的釋放、下丘腦-垂體-腎上腺軸誘導腎上腺釋放糖皮質激素和激活松果體誘導褪黑激素釋放[11]。其中褪黑激素是調節日常和季節性節律的關鍵激素，有研究發現miR-7 在豬松果體細胞中特異性表達并調節褪黑激素的合成[12]。

2.2 對TTFL的影響

對TTFL 的調控表現在對核心基因和核心鐘基因轉錄翻譯后修飾的影響。miRNA 對轉錄翻譯的影響如上文所示：miR-132 的直接靶標是參與染色質重塑和翻譯控制的基因，從而影響晝夜節律。miRNA 對核心鐘基因調控的機制為與其3’-非翻譯區（3’-UTR）的互補區域結合，抑制它們的翻譯并增強mRNA 的降解。例如miR-455-5p 與clock的3’-UTR 結合并調節其穩定性[13]；同樣熒光素酶報告顯示miR-27b-3p 以劑量依賴性方式抑制Bmal1 的3’-UTR 活性，降低了Bmal1 的蛋白表達水平并損害了內源性Bmal1[14]。miRNA 對核心鐘基因的影響，在不同的組織會產生不同的生物節律，比如代謝、進食、先天免疫和休息運動等生物節律。

2.2.1 代謝節律 肝臟的晝夜節律在維持代謝穩態中起重要作用。miR-10a 調節各種肝臟代謝基因，直接抑制RORA 的表達，下調Bmal1 的表達，同時抑制了脂質合成基因、脂肪酸合酶、糖異生、蛋白質合成和膽汁酸合成，這些導致晝夜節律紊亂和肝損傷[15]。同樣miR-181a 增加了脂肪的產生，在永生化骨髓來源的基質細胞以及原發性患者脂肪來源的基質細胞脂肪生成過程中發現，miR-181a 通過靶向per3 產生了脂肪[16]。

2.2.2 進食節律 當進食規律改變時，生物鐘基因會相應的改變。白天進食時改變了per1 的峰值，并且在切除80%小腸的小鼠發現miR-125a 的含量增加[17]。在研究前額葉皮層中的外圍晝夜節律振蕩器參與食物獎勵誘導活動的機制實驗中，發現miR-34a-5p 在大鼠的前額葉皮層誘導節律時鐘基因表達，尤其是per2 和clock，改變大鼠的進食規律[18]。

2.2.3 免疫 晝夜節律紊亂會增加肝細胞癌、肺癌和結腸直腸癌等癌癥發生的概率。per1 通過在細胞周期、生長和凋亡過程抑制細胞生長，miR-34a將per1 作為靶標可控制細胞生長和死亡平衡并降低腫瘤的生長[19]。Bmal1 誘導miR-103 的表達，對大鼠腦動脈鈣通道的晝夜節律進行調節，改變大鼠腦血管收縮力，從而增強大鼠的免疫力[20]。

2.2.4 睡眠節律 強烈的壓力和記憶會改變動物的快速眼動睡眠，所以在休克的動物發現其基底外側杏仁核的miRNA 表達改變和快速眼動睡眠減少。將miR-221 顯微注射到中基底外側杏仁核中，減弱了快速眼動睡眠的減少[21]。將小鼠植入生物遙測單元，連續記錄腦電圖/肌電圖生物電位3 d。發現與對照小鼠相比，miR-155 敲除小鼠的非快速眼球運動、快速眼球運動睡眠次數和腦電波慢波反應均降低[22]。

2.3 對EV的影響

EV 是一組異質的細胞衍生的膜結構，包括外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體和微泡存在于生物體液中，參與多種生理和病理過程。EV 現在被認為是細胞間通信的額外機制，允許細胞交換蛋白質、脂質和遺傳物質[23]。

最近發現EV 會影響晝夜節律系統。首先EV調節促使per 乙酰化的沉默調節蛋白1[24]、調節cry和Bmal1/clock[25]。小鼠血清中的miR-494、miR-152和miR-494 在介導外周晝夜節律振蕩器節律性中發揮作用，現發現這3 種miRNA 在微泡中富集。并且miR-142-3p 通過囊泡運輸在細胞之間進行交流，當抑制囊泡運輸時，整體時鐘基因節律會被改變[11]。

3 lncRNA對晝夜節律的調控

lncRNA 是一類長度至少為200 個核苷酸的線性RNA 轉錄本，雖然lncRNA 的數量遠大于miRNA，但其調控基因表達的機制尚不完全清楚。與miRNA 類似，lncRNA 在視網膜、肝臟和松果體中呈晝夜節律性或差異性表達。在對恒定黑暗和恒定光照條件下，斑馬魚幼蟲下分別有269 和309 個lncRNAs 顯示晝夜節律[26]。

lncRNA 可以靶向鐘基因影響晝夜節律。結腸炎相關的lncRNA（Lnc-UC）可通過組蛋白3降低自身基因沉默活性，增強Rev-erb 轉錄和表達。Lnc-UC的循環表達由Bmal1 通過E-box 元件產生，這些將生物鐘與結腸炎聯系起來。并且發現Lnc-UC 敲除的小鼠晝夜節律紊亂和對結腸炎敏感[27]。用非酒精性脂肪性肝病嚙齒動物模型進行lncRNA 微陣列，發現lncRNA，例如FLRL1、FLRL6 和FLRL2 參與了晝夜節律，其中干擾FLRL2 表達會影響Bmal1的表達，此外FLRL2 還參與Bmal1 介導的非酒精性脂肪性肝病發病機制[28]。TCONS_00044595 在松果體中高度富集，并具有節律性。它受抑制時可以減輕糖氧剝奪條件下培養的松果體細胞和缺氧缺血性腦損傷后松果體體內的clock 激活。miR-182 可以調節松果體時鐘表達，并靶向TCONS_00044595和clock 影響晝夜節律[29]。

4 其他ncRNA

circRNA 是一組具有共價閉合連續環的ncRNA，可作為miRNA 海綿，包含數個與一個或多個不同的miRNA 互補的結合位點，并在轉錄后的基因調控中發揮作用[30]。現也發現部分circRNA 可調節晝夜節律。首先circRNA 具有晝夜節律性，將松果體進行轉錄組分析后獲得了40 個差異表達的circRNA，其中20 個circRNA 在白天顯著上調，20 個circRNA 在夜間顯著上調[31]。CircR-WNK2 存在于大鼠的松果體、視網膜和腦中，并且在松果體和視網膜中高表達。通過競爭性內源性RNA 機制參與調節褪黑激素的分泌。當circR-WNK2 敲低時，miR-328a-3p 表達上調并抑制芳香胺-N-乙酰基轉移酶mRNA 表達。現其他ncRNA 對晝夜節律的調控尚未發現。

5 小結

本文從服務時鐘、客戶時鐘和EV 三方面講述了miRNA 對晝夜節律的影響。miRNA 對SCN 調控主要通過miR-132 減弱重置或夾帶時鐘。光通過視網膜被傳遞到SCN，經過處理和整合后，再通過激素和自主神經系統將環境信息傳遞到外周組織的子時鐘中。不同的組織的晝夜節律主要依靠TTFL 來完成。miRNA 可以調控哺乳動物的代謝、進食、先天免疫、和休息運動節律等。EV 作為蛋白質和ncRNA 的重要細胞間載體，EV 會攜帶ncRNA 影響晝夜節律。后續不僅要檢測EV 攜帶的其他晝夜節律相關分子，而且要驗證這些分子的具體功能及miRNA 對其影響。

目前lncRNA 調控晝夜節律的機制還不完全清楚，但有學者認為lncRNA 的調節機制與miRNA的類似[32]。miRNA 的節奏表達通常由核心時鐘驅動，核心時鐘基因形成互鎖轉錄反饋回路。這些轉錄因子也被證明可以調節lncRNA 的節律表達。lncRNA 調節晝夜節律的機制是否與miRNA 一致需要進一步探討。其他ncRNA 對晝夜節律的影響的研究較少，后續也可進一步研究其他ncRNA 對晝夜節律的調控。