NMM抗腫瘤DNA疫苗原液大腸桿菌菌體蛋白質殘留量檢測方法的建立與驗證

郭潤姿 伊君梅 孫 澳 田 園 車亦偉 邱創鈞 王 宇

固安鼎泰海規生物科技有限公司，河北廊坊 065500

NMM[攜帶編碼腫瘤基因紐約食管鱗狀細胞癌1（NY-ESO-1）、黏蛋白1（MUC-1）、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE-A3）]腫瘤治療性DNA 疫苗裸質粒注射液（簡稱“NMM 抗腫瘤DNA 疫苗”[1]）屬于重組生物制品，系采用大腸桿菌作為受體菌，將帶有編碼腫瘤相關基因的pNMM 質粒轉化進入菌體后制備工程菌，通過發酵、SDS 堿裂解菌體后粗純、精純等步驟而制得的質粒DNA，主要用來治療黑色素瘤、乳腺癌、淋巴癌、皮膚癌等體表實體瘤。由于該產品源自大腸桿菌發酵，生產過程中會有大腸桿菌菌體蛋白質殘留，宿主細胞蛋白質（host cell proteins，HCPs）屬于異源蛋白，成分復雜，包括宿主細胞的結構蛋白以及宿主細胞分泌的催生長因子[2]，且會因生產過程及純化工藝的不同而發生變化。宿主菌菌體蛋白殘留是影響生物制品安全性的主要因素之一，產品中殘存的菌體蛋白等雜質可能是引起機體過敏反應的重要原因[3-4]，現行版《中華人民共和國藥典》[5]中規定對依托大腸桿菌發酵的重組生物制品中宿主菌蛋白質殘留量應不高于0.1%，對于依托酵母菌生產的重組生物制品，宿主菌蛋白質殘留量的控制更為嚴格（應不高于0.05%）。

目前宿主細胞蛋白質的分析檢測技術分為定性和定量兩種方式，其中定性的檢測方法有二維電泳法（2D-PAGE）[6]，而定量檢測的方法有酶聯免疫法[2，7]、毛細管電泳法等[8]。本研究選用美國Cygnus 公司的大腸桿菌宿主細胞ELISA 檢測試劑盒進行檢測，該試劑盒帶有用抗大腸桿菌菌體蛋白抗體包被的酶標板，其抗體是由包含如DH-5α、BL21、K12、JM109 等多種大腸桿菌菌體混合溶菌液反應產生的。本品生產使用的基因工程菌為XL10-Gold，為大腸桿菌K12 系菌株中的一個變種，因此可以使用該試劑盒進行大腸桿菌菌體蛋白質殘留量測定。該方法具有簡潔、快速、靈敏度高等優點，具有較廣泛的應用性。本研究擬從專屬性、檢測限、定量限、線性、精密度、準確度、耐用性等方面進行驗證，以便確認該方法是否適用于NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質殘留量的檢測。

1 儀器與試劑

MB-580 型多功能酶標儀及數據分析軟件（深圳匯松科技發展有限公司）；振蕩器。

大腸桿菌宿主細胞ELISA 檢測試劑盒（美國Cygnus）；原液空白溶劑（DNA 溶解液，主要成分：13.6 mmol/L 磷酸氫 二 鈉、3.2 mmol/L 磷酸二氫鈉、6 g/L 氯化鈉，由固安鼎泰海規生物科技有限公司制備）；NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液（批號：Bulk20200601、Bulk20200602、Bulk20200703、Bulk20200704、Bulk20200805，由固安鼎泰海規生物科技有限公司生產）。

2 方法與結果

2.1 方法的建立

2.1.1 標準品溶液 取試劑盒中菌體蛋白標準品溶液，濃度分別為0、1、3、12、40、100 ng/ml，備用。

2.1.2 檢測方法 準確吸取菌體蛋白標準品溶液，原液空白溶劑以及供試品各25 μl 加入到酶標板內，每個溶液平行2 個復孔，每孔加入酶標抗體100 μl，輕輕振蕩混勻，用蓋膜板蓋住酶標板，于室溫（20℃～28℃）180 rpm 振蕩孵育90 min；小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔用350 μl 1×洗滌工作液充分洗滌5 次，每次洗板間隔10 s，用吸水紙拍干；向每孔中加入100 μl TMB 底物液，輕輕振蕩混勻，用蓋膜板蓋板后室溫（20℃～28℃）靜置孵育30 min；每孔加入100 μl 反應終止液，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定450 nm 處吸光值，并記錄各樣品于450 nm 下的吸光值；采用酶標儀中自帶的分析軟件，以宿主菌蛋白質標準品濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線并求得回歸方程。

2.1.3 標準曲線類型的選擇 目前使用ELISA 法檢測宿主菌蛋白質殘留量數據的處理多為線性回歸模型[2，7，9]，線性回歸模型納入至各國藥典具有較長的應用歷史，但線性回歸只是在一個范圍內對反應的近似模擬，真實的生物學反應多為S 型曲線[10-12]。本研究使用四參數logistic 曲線，方程形式為y=D+（A-D）/[1+（x/C）B]，式中y表示反應值；x表示藥物作用濃度；A、B、C、D 為4 個特征性參數，其中A為反應下漸近線，D 為反應上漸近線，B 為吸光值增長速率參數，C 為半數反應濃度。通過收集大量的測試結果發現線性擬合方程的R2＞0.98，使用四參數logistic 曲線擬合方程R2值能達到0.9999 以上，表明四參數logistic 曲線擬合的方式能更準確地反映樣品中宿主菌蛋白質的含量，故選擇四參數logistic 法擬合標準曲線。

2.1.4 樣品稀釋倍數的確定 將三個批次DNA 疫苗原液用原液空白溶劑稀釋5 倍作為供試品溶液，對比稀釋5 倍的供試品溶液以及DNA 疫苗原液吸光值并計算宿主菌蛋白質含量。由表1 可知原液空白溶劑、DNA 疫苗原液以及稀釋5 倍后的供試品吸光值均與0 ng/ml 標準品吸光值接近，宿主菌蛋白質含量檢測結果均低于該試劑盒的最低有效定量限（1 ng/ml），表明原液空白溶劑對宿主菌蛋白質的檢測無干擾，使用本方法檢測宿主菌蛋白質含量時，DNA 疫苗原液不需要稀釋。

表1 吸光值以及宿主菌蛋白質含量

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性 溶液A：0 ng/ml 標準液與DNA 疫苗等比混合；溶液B：80 ng/ml 標準液與DNA 疫苗等比混合；溶液C：40 ng/ml 標準品；溶液A 平行3 個復孔、溶液B 平行3 個復孔，溶液C 平行6 個復孔。照2.1.2 項下對各溶液中宿主菌蛋白質含量進行檢測，溶液A 與溶液B 的含量之差如在溶液C 含量測定值的95%可信區間內（即x±2SD），表明供試品不會對該檢測方法產生干擾作用。當結果大于可信區間時，表示樣品對檢測有增強作用；當結果小于可信區間時，表示樣品對檢測有抑制作用[13]。結果見表2。溶液C 含量均值為42.2581 ng/ml，標準差SD值為0.73，溶液A 與溶液B 的含量之差為43.0206 ng/ml，介于x±2SD區間（40.7981 ～43.7181 ng/ml），表明DNA 疫苗原液對宿主菌蛋白質含量的檢測無干擾。

表2 專屬性試驗結果

2.2.2 檢測限與定量限 對0 ng/ml 標準液連續測定6 次，計算吸光值x和SD，根據標準曲線求得“x+3SD”對應的宿主菌蛋白質的含量，即為本試劑盒的檢測限；“x+10SD”對應的宿主菌蛋白質含量即為本試劑盒的定量限。由實驗結果可知本方法的檢測限為0.41 ng/ml，定量限為0.98 ng/ml，其定量限濃度與試劑盒說明書定量限濃度1 ng/ml 相符。

2.2.3 線性和范圍 對試劑盒中0、1、3、12、40、100 ng/ml 標準液進行檢測，選用四參數方程進行回歸分析，回歸方程為：y=9.8481+{-9.7831/[1+（x/569.7997）1.0407]}，R2值可達0.99999。標準曲線見圖1，本方法在0 ～100 ng/ml 范圍內線性關系良好。

圖1 宿主菌蛋白質標準曲線

2.2.4 精密度

2.2.4.1 重復性 將試劑盒中1、12、40 及100 ng/ml的E.coliHCP 標準液重復6 個復孔，計算上述4 個標準溶液宿主蛋白含量的RSD值及回收率。由實驗結果可知1 ng/ml 標準液濃度RSD值為11.61%，變異程度較大，但仍符合試劑盒中關于低濃度下變異系數＜20% 的要求。當蛋白含量較高時，板孔間變異系數均＜10%。回收率測試結果也符合試劑盒關于回收率的規定（回收率：80%～120%）。見表3。

表3 重復性實驗結果

2.2.4.2 中間精密度 取本品（Bulk20200602）6 份進行檢測，每份供試品測定2 次吸光值。計算6 份供試品中吸光值均值的RSD值以及宿主菌蛋白質含量。由表4 可知6 份供試品吸光值均值RSD值為3.09%，而宿主菌蛋白質含量均低于該方法的定量限1 ng/ml，故無評價RSD值的必要。

表4 中間精密度實驗結果

2.2.5 準確度 將DNA 疫苗原液分別與64、80、100 ng/ml 的E.coliHCP 標準液進行等比混合，作為低、中、高濃度的加標溶液（即宿主菌蛋白質加標量分別為32、40、50 ng/ml），每個濃度的加標溶液平行稀釋3 份。將0 ng/mlE. coliHCP 標準液與DNA 疫苗原液等比混合作為本底溶液。照2.1.2 項下對各溶液中宿主菌蛋白質含量進行檢測，每種溶液平行3 個復孔，計算低、中、高濃度加標溶液的回收率以及RSD值。9 份溶液的加標回收率均值為100.35%，RSD值為3.58%，該方法的準確度結果良好。見表5。

表5 準確度實驗結果

2.2.6 耐用性 分別由不同人員使用不同批次試劑盒對NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質含量進行測定，結果顯示DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質含量均在該方法的定量限1 ng/ml 左右，表明該方法耐用性良好。

2.3 樣品的測定

用該方法對5 批DNA 疫苗原液進行檢測，宿主菌蛋白質含量均在該方法的定量限濃度1 ng/ml左右，折算為每毫克質粒DNA 中宿主菌蛋白質殘留量，結果顯示宿主菌蛋白質殘留量均在1 ng/mg左右。見表6。該結果遠低于相關指導原則[14]中規定的宿主菌蛋白質殘留量不高于1 μg/mg 的質量標準，表明固安鼎泰海規生物科技有限公司（本公司）的純化工藝可以有效去除產品中宿主菌蛋白質。

表6 5批產品中宿主菌蛋白質殘留量檢測結果

3 討論

大腸桿菌是原核表達系統中應用最普遍的基因工程菌之一，許多人細胞因子類產品，如注射用干擾素、人粒細胞刺激因子、成纖維細胞生長因子都是在該宿主菌中表達?；蛑委熡觅|粒DNA 產品[15]以及DNA 疫苗產品，如子宮頸癌DNA 疫苗[16]、乙肝DNA 疫苗[17]、印度已獲批上市的新冠DNA 疫苗[18]等，亦以大腸桿菌作為生產用工程菌。本公司抗腫瘤DNA 疫苗也是采用大腸桿菌作為生產用工程菌，所以要在終產品中檢測菌體蛋白質殘留量。

本研究采用山羊抗大腸桿菌菌體蛋白抗體建立的雙抗體夾心法對產品菌體蛋白質殘留量進行檢測，該方法具有靈敏度高、重復性好等特點，由于該試劑盒使用了多種大腸桿菌菌體蛋白質的抗體，可作為大腸桿菌菌體蛋白質殘留量檢測的通用方法。本研究選擇四參數logistic 曲線對數據進行處理，可大大降低主觀因素對結果的影響，并提高計算的精確度[10]。本研究顯示DNA 疫苗對大腸桿菌宿主菌蛋白質殘留量的檢測無干擾，本方法定量限為0.98 ng/ml，該試劑盒在12 ～100 ng/ml 的范圍內濃度變異系數＜10%，而在低濃度（1 ng/ml 左右）下變異系數較大，但仍符合試劑盒低濃度下變異系數應＜20%的要求。該方法具有良好的回收率，回收率均值為100.35%。經對多批次NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質殘留量進行檢測，結果顯示殘留量均在1 ng/mg 左右，遠低于《中華人民共和國藥典》中宿主菌蛋白質殘留量不高于1 μg/mg的規定。

本研究成功建立了NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中大腸桿菌菌體蛋白質殘留量ELISA 檢測方法，該方法具有良好的專屬性、檢測限、定量限、線性、精密度、準確度。方法學研究結果表明，Cygnus 大腸桿菌宿主細胞檢測試劑盒適用于本公司生產的NMM 抗腫瘤DNA 疫苗原液中宿主菌蛋白質殘留量的檢測，該方法可為同類產品或其他依托大腸桿菌發酵的重組生物制品中宿主菌菌體蛋白質殘留量的檢測提供參考。