丹參酮ⅡA對人肺腺癌細胞A549 生物學行為的影響初探*

王 布，鄒 芳，袁勝芳，項保利，張志華，顧 鑫，牛向欣，趙建清

（河北北方學院附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，河北 張家口 075000）

2020 年全球惡性腫瘤統計數據顯示，肺癌是惡性腫瘤患者的主要死因之一，其發病率約為11.4%，僅次于乳腺癌［1］。肺腺癌為非小細胞肺癌（約占肺癌的80%）最常見亞型（約占50%）［2-3］。非小細胞肺腺癌患者早期無特征性表現，確診時多處于中晚期，且預后較差、生存時間一般較短。現有治療手段常伴明顯的副作用，致使患者機能下降、生活受限。研究中醫藥的抗腫瘤機制對指導臨床用藥及開發新的抗腫瘤藥物具有積極意義。丹參始載于《神農本草經》，具有活血、散瘀作用［4］，其主要成分丹參酮ⅡA可影響多種腫瘤細胞的生物學行為，抑制其增殖、推動程序性死亡［5-8］。本研究中初步探討了丹參酮ⅡA對人肺腺癌細胞A549 生物學行為的影響及其相關機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：Eculipse Ts2 型倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Spectra Max M5 型酶標儀（美國MD 公司）；BBD6220型CO2培養箱（美國ThermoFisherScientific公司）；AriaⅢ型流式細胞儀（美國BD公司）。

試藥：丹參酮ⅡA（北京百靈威科技有限公司，批號為LUC0Q43，含量97%）；二甲基亞砜（DMSO，武漢賽奧斯生物科技有限公司，批號為B326BA3887，含量≥99.5%）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶（美國Hyclone 公司，批號分別為B01124701，AD24221175）；Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號為15596-026）；Annexin V/碘化丙啶（PI）雙染試劑盒（美國BD 公司，批號為9312842）；胎牛血清（FBS）培養基（美國Gibco 公司，批號為42Q0682K）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT -qPCR）試 劑 盒（ 美 國 Promega 公 司，批 號 為0000497768）；Transwell小室（美國Corning公司，批號為3412）；四甲基偶氮唑藍（MTT）溶液（美國Sigma 公司，批號為M2128，質量濃度為5 mg/mL）；基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、整合素（integrin）α2、integrin β1、細胞周期蛋白（Cyclin）B1、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的抗體（上海艾博抗有限公司，批號分別為ab181286，ab137867，ab133557，ab136524，ab32072，ab4051）。

細胞：人肺腺癌A549細胞株（上海奧陸生物科技有限公司）。

1.2 方法

細胞培養與分組：將A549 細胞置含10%FBS 的DMEM 培養基（簡稱培養基）中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。以酶消化法（0.25%EDTA 胰蛋白酶溶液）傳代，培養細胞至對數生長期。實驗分為空白對照組（A組，等體積培養基），順鉑組（B 組，10 μg/mL 順鉑），丹參酮ⅡA（臨用前以DMSO 溶解）低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組，5，10，20 μmol/L）。

細胞增殖能力：取對數生長期的A549細胞，將細胞密度調整為4×103個/孔，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，細胞貼壁后棄去培養液。各組細胞加入相應藥物或培養基10 μL 處理，均設6 個復孔，繼續培養24，48，72 h，加入20 μL MTT 溶液培養4 h，棄去上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，以酶標儀在504 nm 波長處檢測吸光度（OD），并計算增殖率。

細胞遷移能力：取對數生長期的A549細胞，將細胞密度調整為3×105個/孔，待細胞貼壁后在孔內劃3 條劃痕，用PBS 清洗并去除懸浮細胞，各組細胞加入相應藥物或培養基處理，平行3 次，用倒置顯微鏡于0（給藥即刻），24 h時取樣拍照，并計算遷移細胞數。

細胞侵襲能力：取對數生長期的A549 細胞，用培養基洗滌，將細胞密度調整為1×105個/孔。取200 μL細胞懸液加入Transwell 上室中，各組細胞加入相應藥物或培養基處理，平行3 次；取培養基加入Transwell 下室。培養24 h 后，上室內的細胞用棉簽擦去，以甲醇固定下室細胞，再用0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機取5個視野統計并記錄侵襲細胞數。

細胞凋亡及細胞周期：采用流式細胞術。各組細胞加入相應藥物或培養基處理24 h，取100 μL 細胞懸液，加入10 μL PI、5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫下避光培養30 min。加入5 μL PI后繼續避光培養10 min。以流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并計算凋亡率。用乙醇固定細胞，PI染色處理后的RNA，再以流式細胞儀測定細胞DNA 含量，統計各周期細胞占比。2個實驗均平行3次。

mRNA和蛋白表達水平：取經藥物或培養基處理后的各組A549 細胞，提取mRNA，嚴格按RT - qPCR 試劑盒說明書操作。以GAPDH 為內參，檢測mRNA表達水平。采用Western blot法，取經相應藥物或培養基處理后的各組A549細胞，接種于6孔板中，培養24 h后，收集細胞提取總蛋白，以BCA 法檢測蛋白濃度；電泳，轉膜，封閉，加入MMP-2（1∶500，V/V），MMP-9（1∶500，V/V），integrin α2（1∶200，V/V），integrin β1（1∶200，V/V），Cyclin B1（1∶200，V/V），Caspase-3（1∶200，V/V）的一抗，4 ℃孵育過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜，加入二抗繼續孵育2 h；ECL發光液顯色，以凝膠成像儀成像，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參檢測蛋白表達水平。

2 結果

2.1 細胞增殖情況

與A 組比較，B 組及C1組、C2組、C3組細胞處理24，48，72 h 時的增殖率均顯著降低（P＜0.05），且增殖率隨丹參酮ⅡA質量濃度的增加而降低。詳見表1。

表1 各組細胞增殖率比較（±s，%，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation rate in each group（±s，%，n=6）

表1 各組細胞增殖率比較（±s，%，n=6）Tab.1 Comparison of proliferation rate in each group（±s，%，n=6）

注：與A組比較，*P ＜0.05。表2至表5同。Note：Compared with those in the group A，*P ＜0.05（for Tab.1 - 5）.

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值72 h 1.35±0.19 0.61±0.03*1.10±0.19*0.87±0.04*0.63±0.02*38.704 0.000劑量（μg/mL）0 10 5 10 20 24 h 0.95±0.13 0.55±0.04*0.77±0.10*0.66±0.06*0.53±0.03*27.330 0.000 48 h 1.08±0.14 0.60±0.04*0.93±0.07*0.77±0.05*0.59±0.05*46.967 0.000

2.2 細胞遷移及侵襲情況

與A 組比較，B組及C1組、C2組、C3組處理24 h的遷移細胞及侵襲細胞數量均顯著減少（P＜0.05），且兩者數量隨丹參酮ⅡA質量濃度的升高而減少。詳見表2。

表2 各組細胞遷移及侵襲數比較（±s，個，n=3）Tab.2 Comparison of the numbers of migrating and invading cells in each group（±s，cell，n=3）

表2 各組細胞遷移及侵襲數比較（±s，個，n=3）Tab.2 Comparison of the numbers of migrating and invading cells in each group（±s，cell，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值劑量（μg/mL）0 10 5 10 20遷移細胞數134.50±7.66 62.83±3.19*116.67±5.47*82.33±5.28*65.50±3.45*219.878 0.000侵襲細胞數117.33±6.41 50.17±3.82*95.83±4.26*67.67±4.32*48.83±3.43*257.353 0.000

2.3 細胞凋亡情況

與A 組比較，B 組及C1組、C2組、C3組細胞處理24 h時的凋亡率均顯著升高（P＜0.05），且凋亡率隨丹參酮ⅡA質量濃度的增加而升高。詳見表3、圖1。

圖1 流式細胞圖Fig.1 Results of flow cytometry detection

表3 各組細胞凋亡率及細胞周期分布情況比較（±s，%，n=3）Tab.3 Comparison of apoptosis rate and cell cycle distribution in each group（±s，%，n=3）

表3 各組細胞凋亡率及細胞周期分布情況比較（±s，%，n=3）Tab.3 Comparison of apoptosis rate and cell cycle distribution in each group（±s，%，n=3）

組別凋亡率細胞周期劑量（μg/mL）0 10 5 10 20 A組B組C1組C2組C3組F值P值3.63±1.38 48.57±4.50*24.53±3.45*36.12±4.78*49.96±4.48*143.522 0.000 G0/G1期56.42±2.13 83.28±0.85*67.77±1.46*75.54±1.04*84.01±1.25*398.523 0.000 S期26.48±1.36 12.45±0.86*19.06±1.32*15.98±0.96*11.88±1.21*158.429 0.000 G2/M期17.11±1.18 4.27±0.19*13.17±0.97*8.48±0.68*4.12±0.15*338.795 0.000

2.4 細胞周期分布

與A 組比較，B組及C1組、C2組、C3組處理24 h時的G0/G1期細胞占比均顯著升高（P＜0.05），且細胞占比隨丹參酮ⅡA質量濃度的增加而增加；B組及C1組、C2組、C3組的S 期、G2/M 期細胞占比均顯著減少（P＜0.05），且隨丹參酮ⅡA質量濃度的增加而減少。詳見表3、圖2。

圖2 細胞周期分布Fig.2 Distribution of cell cycles

2.5 mRNA 及蛋白表達水平

與A 組比較，B 組及C1組、C2組、C3組的MMP - 2，MMP - 9，integrin α2，integrin β1，Cyclin B1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），且隨丹參酮ⅡA質量濃度的增加而降低；B組及C1組、C2組、C3組細胞Caspase-3的mRNA及蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），且隨丹參酮ⅡA質量濃度的增加而升高。詳見表4、表5、圖3。

圖3 蛋白表達印跡圖Fig.3 Western blot of protein expression

表4 各組細胞mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of mRNA expression levels in each group（±s，n=3）

表4 各組細胞mRNA表達水平比較（±s，n=3）Tab.4 Comparison of mRNA expression levels in each group（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值Caspase-3 1 4.87±0.41*1.87±0.47*3.30±0.30*5.03±0.34*158.582 0.000 MMP-2 1 0.66±0.03*0.92±0.03*0.73±0.12*0.65±0.04*45.319 0.000 MMP-9 1 0.48±0.04*0.93±0.02*0.64±0.03*0.46±0.03*470.624 0.000 integrin α2 1 0.39±0.03*0.65±0.05*0.61±0.02*0.37±0.01*478.055 0.000 integrin β1 1 0.56±0.03*0.94±0.01*0.62±0.02*0.55±0.04*499.374 0.000 Cyclin B1 1 0.36±0.05*0.71±0.09*0.48±0.05*0.36±0.07*129.818 0.000

表5 各組細胞蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression levels in each group（±s，n=3）

表5 各組細胞蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.5 Comparison of protein expression levels in each group（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值MMP-2 1.03±0.02 0.61±0.04*0.87±0.03*0.69±0.05*0.63±0.03*149.906 0.000 MMP-9 1.02±0.03 0.40±0.05*0.89±0.02*0.60±0.04*0.41±0.02*395.394 0.000 integrin α2 0.97±0.03 0.37±0.03*0.62±0.04*0.57±0.03*0.34±0.02*421.856 0.000 integrin β1 1.02±0.02 0.49±0.04*0.88±0.03*0.59±0.02*0.48±0.05*304.908 0.000 Cyclin B1 0.98±0.02 0.34±0.04*0.67±0.06*0.46±0.04*0.33±0.06*200.984 0.000 Caspase-3 1.02±0.01 4.97±0.39*1.74±0.42*3.18±0.34*5.12±0.41*168.790 0.000

3 討論

肺癌由支氣管黏膜病變引發，其病因病機復雜。其中非小細胞肺腺癌特征為淋巴細胞浸潤密集，且在早期易發生轉移。化學藥物治療（簡稱化療）、手術切除及放射治療（簡稱放療）是其常規治療方法。但現有臨床治療方案無法顯著改善肺癌患者的生存率，只能延緩病程發展。丹參酮ⅡA作為丹參的活性成分之一，常用于保護心腦血管，近年來發現丹參及其活性成分具有抗腫瘤作用。本研究結果顯示，C1組、C2組、C3組A549細胞的增殖率均明顯降低，遷移和侵襲細胞數均明顯減少，且與丹參酮ⅡA的質量濃度呈負相關；C1組、C2組、C3組A549 細胞的凋亡率均明顯升高，且與丹參酮ⅡA的質量濃度呈正相關。在一定程度上證明了丹參酮ⅡA的抗腫瘤作用。

細胞周期分為分裂期和為細胞分裂做準備的分裂間期，分裂間期受基因表達控制可合成多種蛋白對細胞的代謝活動進行調控。在DNA 合成的前中后3 個階段均有調控細胞周期的重要時間節點，且均配備嚴格的調控機制［9］。其中Cyclin 蛋白為調控細胞周期的關鍵機制之一，可通過促進G2/M 期轉換，進而加快細胞周期的進展，其表達失控與細胞的惡性增殖關系密切［10］。細胞發生程序性死亡（即凋亡）的過程有助于維持內環境穩定，是機體控制細胞數異常增多的理想方法。Caspase-3 在細胞凋亡中起重要作用，是執行過程的關鍵酶，可被外源性或內源性路徑激活，林晉等［11］的研究發現，可通過升高Caspase - 3 的表達水平來推動人骨肉瘤細胞發生程序性死亡。提示Caspase - 3 的表達上調可誘導A549 細胞凋亡增加，可能也是丹參酮ⅡA發揮抗腫瘤作用的機制之一。腫瘤細胞的侵襲和轉移能力使其能轉移到除原發病灶外的其他臟器，在腫瘤轉移過程中發揮重要作用。有研究顯示，MMP - 2 和MMP- 9 水平升高的情況存在于多種腫瘤細胞侵襲轉移過程中，且兩者的水平變化可影響發生轉移的腫瘤細胞數。黃敏等［12］的研究發現，瘤易感性候選基因2（CASC2）可通過降低MMP - 2 蛋白表達而抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。左文娜等［13］的研究發現，喉癌組織中MMP-9 呈高表達狀態，降低MMP-9 表達水平可抑制喉癌細胞的增殖、遷移、侵襲，促進喉癌細胞的凋亡。熊濤等［14］的研究證明，毛萼乙素可通過調控lncRNA CPS1-IT1表達，減少MMP-2和MMP-9蛋白表達量，抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲。integrin 作為黏附分子，存在于細胞表面。細胞的生物學行為可通過integrin 傳導的雙向信號變化來調節。研究表明，integrin α2和integrin β1在前列腺癌［15］、宮頸癌［16］等不同腫瘤細胞株中呈高表達，促進腫瘤細胞生長和侵襲。本研究結果顯示，與A組比較，C1組、C2組、C3組A549細胞MMP-2，MMP-9，integrin α2，integrin β1，Cyclin B1 mRNA 表達水平均明顯降低，且與丹參酮ⅡA質量濃度呈負相關；Caspase-3 mRNA表達水平明顯升高，且與丹參酮ⅡA質量濃度呈正相關。說明丹參酮ⅡA對A549細胞的抗腫瘤作用可能通過調控上述mRNA表達水平實現。

綜上所述，丹參酮ⅡA可抑制A549 細胞的侵襲、遷移、增殖，促進其凋亡，其機制可能與下調MMP - 2，MMP - 9，integrin α2，integrin β1，Cyclin B1 的表達和上調Caspase-3的表達有關。