白花蛇舌草化學(xué)成分及其抗結(jié)腸癌活性初探*

張其愛，楊佳彬，林冠麗，李志健，曾彩芳△

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 511436； 2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 511447）

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa（Willd.）Roxb. 的全草，能清熱解毒、利濕通淋，有抗腫瘤作用［1-3］，而國內(nèi)臨床常用于治療中晚期原發(fā)性肝癌［4］。結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在我國均逐年上升，嚴(yán)重威脅人民健康。根治性腫瘤切除術(shù)為臨床常用治療方式［5］，但患者術(shù)后的5 年生存率僅50%～60%，且對于術(shù)后復(fù)發(fā)及不能手術(shù)患者，多藥耐藥性（MDR）為結(jié)腸癌化學(xué)藥物治療（簡稱化療）失敗的重要原因［6-7］。白花蛇舌草抗腫瘤機制為增強宿主非特異性免疫，以抑制耐藥型結(jié)腸癌細(xì)胞的生長并促進凋亡［8-9］，而目前尚無有關(guān)其化學(xué)成分和藥理作用研究的報道。為探究其抗耐藥型結(jié)腸癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，前期對白花蛇舌草化學(xué)成分進行了研究，初步篩選出其抗結(jié)腸癌的有效部位為乙酸乙酯部位，本研究中進一步對該有效部位的化學(xué)成分進行探討?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與細(xì)胞

1.1 儀器

CP225D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；Bruker AV-400/500 FT 型傅立葉變換超導(dǎo)核磁共振譜儀（德國Bruker 公司）；Q-TOF micro 型四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；WRX - 4 型熔點測定儀（上海星堯科學(xué)儀器有限公司）；RV - 8 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA 公司）；Pure C-815型中壓制備色譜儀（瑞士Buchi 公司）；Agilent 1260 Infinity Ⅱ制備型高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent 公司）；311 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試藥

100～200 目液相色譜柱用硅膠（煙臺黃海化工有限公司，批號為0210056）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT 試劑（美國Aladdin公司，批號分別為D201041，A191008）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco 公司，批號分別為8120485，BC20200311，2020490C，PYM2020011）；5-氟尿嘧啶（5-FU，天津金耀有限公司，批號為201607）；有機試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。白花蛇舌草藥材飲片（廣州致信中藥飲片有限公司，批號為20200123），產(chǎn)地為廣西壯族自治區(qū)玉林市，由南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室張宏偉教授鑒定為正品。

1.3 細(xì)胞

人結(jié)腸癌HT-29 和SW480 細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的提取與分離

取藥材飲片樣品30 kg，精密稱定，用95%乙醇（樣品質(zhì)量的6 倍）加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，60 ℃下減壓濃縮至無醇味，加水稀釋制得混懸液（4～5 L），依次用石油醚、乙酸乙酯、飽和正丁醇萃取，以混懸液-溶劑（1∶1，V/V）反復(fù)萃取至萃取溶劑色淡，合并各萃取液，并減壓濃縮；取乙酸乙酯部位上中壓制備色譜，以乙酸乙酯和石油醚梯度洗脫［0，10%，20%，40%，60%，80%，100%（乙酸乙酯/石油醚）］，得7 個部位；取40%乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚和乙酸乙酯進行梯度洗脫［0，20%，40%，60%，100%（乙酸乙酯/石油醚）］，洗脫液經(jīng)薄層色譜（TLC）分析、合并，并經(jīng)制備型高效液相色譜純化，得9個化合物。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淺綠色固體；香草醛- 濃硫酸試劑顯紫色；mp. 130～131 ℃；ESI - MS：m/z439.8［M - H］-。1H - NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.21（1H，t，J= 3.5 Hz，H-12），2.75（1H，dd，J=13.7，4.2 Hz，H-18），1.15，1.09，1.05，1.03，0.93，0.91，0.81（CH3× 7，s，H - 23，24，25，26，27，29，30）。13C - NMR（CDCl3，100 MHz）δ：184.0（C-28），143.6（C-13），122.4（C-12），56.2（C-3），55.3（C-5），47.4（C-17），46.9（C-19），46.6（C-14），45.8（C-8），41.7（C-9），41.0（C-18），39.3（C-4），39.1（C-10），36.8（C-1），34.1（C-22），33.8（C-21），33.0（C-29），32.4（C-7），32.1（C-23），30.7（C-20），27.7（C-15），26.4（C-2），25.8（C-27），23.5（C-30），23.5（C - 16），22.9（C - 11），21.4（C - 26），19.5（C-6），17.0（C-25），15.0（C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］的報道一致，故鑒定化合物1為齊墩果酸。

化合物2：白色固體；香草醛-濃硫酸試劑顯紫色；mp. 254～255 ℃。1H - NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.67（1H，s，H-29a），4.55（1H，s，H-29b），1.63（1H，s，H-30），1.00，0.92，0.91，0.86，0.82（H × 5，s，H - 23，24，25，26，27）。13C - NMR（CDCl3，400 MHz）δ：181.0（C -28），149.4（C-20），108.7（C-29），58.2（C-3），56.3（C - 5），53.9（C - 17），48.8（C - 19），48.1（C - 14），46.3（C - 8），45.8（C - 9），41.47（C - 4），39.61（C -18），38.3（C-15），37.4（C-10），36.0（C-1），35.8（C-2），33.1（C-13），32.5（C-7），31.1（C-16），29.5（C-21），28.6（C-15），25.6（C-22），24.5（C-2），20.3（C-24），20.0（C-28），18.5（C-27），18.3（C-6），14.9（C-23），14.8（C-26），13.6（C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］的報道一致，故鑒定化合物2為白樺脂酸。

化合物3：淡黃色粉末；香草醛- 濃硫酸試劑顯紫色；mp. 285～286 ℃；ESI - MS：m/z469.1［M - H］-。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：5.5（1H，s，H-12），1.41，1.39，1.34，1.26，1.10，1.07，0.77（3H×7，s，23，24，25，26，27，28，29）。13C-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：199.01（C-12），180.9（C-30），169.0（C-13），127.3（C - 12），86.6（C - 4），60.0（C - 17），56.3（C - 5），55.1（C - 3），52.4（C - 19），50.2（C - 14），45.5（C -8），43.5（C-9），42.0（C-18），40.1（C-10），38.7（C-1），33.8（C - 22），33.6（C - 21），33.2（C - 29），32.3（C -7），31.9（C-23），31.0（C-20），30.8（C-15），29.7（C-2），29.0（C - 27），27.5（C - 30），27.0（C - 11），23.5（C - 16），23.0（C - 11），21.3（C - 26），20.6（C - 6），19.7（C-25），18.2（C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］的報道一致，故鑒定化合物3為熊果酸。

化合物4：淺黃色粉末；香草醛- 濃硫酸試劑顯天藍色；mp. 305～306 ℃。1H - NMR（CDCl3，400 MHz）δ：8.05（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.39（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.44（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.19（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。13C-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：176.4（C - 4），164.4（C - 7），161.2（C - 9），159.7（C - 4′），156.7（C - 5），147.3（C - 2），136.1（C - 3），130.0（C -2′6′），122.1（C-1′），115.9（C-3′5′），103.5（C-10），98.7（C-6），94.0（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］的報道一致，故鑒定化合物4為山柰酚。

化合物5：黃色針狀結(jié)晶；香草醛- 濃硫酸試劑顯天藍色；mp.301～302 ℃。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.5（1H，s，OH-5），10.8（1H，s，OH-3），9.57（1H，s，OH-3′），9.3（2H，s，OH-7，4′），7.66（1H，d，J=2.0 Hz，H - 2′），7.53（1H，d，J= 2.0 Hz，H - 6′），6.82（1H，d，J= 8.0 Hz，H - 5′），6.39（1H，d，J= 2.0 Hz，H - 8），6.17（1H，d，J=2.0 Hz，H-6）。13C-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：175.4（C - 4），163.4（C - 7），160.2（C -9），159.7（C-4′），156.7（C-4′），156.1（C-5），146.8（C - 2），135.1（C - 3），119.0（C - 2′6′），122.1（C -1′），115.6（C - 3′5′），103.2（C - 10），98.2（C - 6），93.0（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］的報道一致，故鑒定化合物5為槲皮素。

化合物6：紅色針晶；溶于甲醇；Borntrager′s 反應(yīng)和乙酸鎂反應(yīng)為陽性；香草醛- 濃硫酸試劑顯黃色；mp. 255～256 ℃。1H - NMR（CD3OD，400 Hz）δ：12.21（1H，s，OH - 1），12.10（1H，s，OH - 8），10.15（1H，s，OH - 3），7.61（1H，m，H - 4），7.28（1H，d，J= 2.2 Hz，H - 5），7.08（1H，d，J= 6.7 Hz，H - 2），6.68（1H，m，H - 7），2.46（3H，s，CH3）。13C - NMR（CD3OD，400 Hz）δ：164.3（C-1），107.2（C-2），164.9（C-3），106.5（C-4），120.5（C - 5），149.8（C - 6），124.7（C - 7），161.9（C-8），193.1（C-9），133.5（C-11），113.2（C-12），103.9（C - 12），108.7（C - 13），135.6（C - 14），21.3（- CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］的報道一致，故鑒定化合物6為大黃素。

化合物7：淡黃色粉末；溶于吡啶；Borntrager′s 反應(yīng)和乙酸鎂反應(yīng)為陽性；香草醛- 濃硫酸試劑顯黃色；mp. 321～322 ℃。1H - NMR（DMSO -d6，400 Hz）δ：11.91（2H，s，OH - 1，8），8.12（1H，s，OH - 8），7.82（1H，s，OH - 3），7.75（1H，m，H - 4），7.73（1H，d，J=2.1 Hz，H - 5），7.40（1H，d，J= 7.8 Hz，H - 2）。13C -NMR（DMSO-d6，400 Hz）δ：164.3（C-1），124.2（C-2），138.9（C - 3），119.5（C - 4），118.5（C - 5），137.8（C -6），124.7（C - 7），161.9（C - 8），193.1（C - 9），181.7（C - 10），133.2（C - 4a），118.9（C - 8a），118.7（C -1a），135.6（C - 5a），163.5（- COOHC）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］的報道一致，故鑒定化合物7為大黃酸。

化合物8：淡黃色粉末；mp. 240～2 412 ℃；ESI -MS：m/z268［M - H］-。1H - NMR（CDCl3，400 Hz）δ：8.15（1H，d，J=8.0 Hz，H-8），7.43（1H，d，J=8.0 Hz，H-7），8.06（1H，s，H-5），7.76（1H，s，H-4），7.73（1H，s，H-1），4.02（3H，s，- OCH3），2.48（3H，s，- CH3）。13C -NMR（CDCl3，400 Hz）δ：186.7（C - 10），181.3（C - 9），153.1（C-2），1149.3（C-3），143.7（C-6），131.7（C-7），134.5（C - 5a），130.6（C - 10a），121.7（C - 8），119.3（C - 5），117.4（C - 10a），113.3（C - 9a），110.7（C- 4），103.4（C- 1），54.1（-OCH3），23.3（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］的報道一致，故鑒定化合物8為蘆薈大黃素。

化合物9：淡黃色粉末；溶于吡啶；Borntrager′s 反應(yīng)和乙酸鎂反應(yīng)為陽性；mp.196～197 ℃。1H-NMR（CDCl3，400 Hz）δ：11.91（2H，s，OH-1，8），8.12（1H，s，OH- 8），7.82（1H，s，OH-3），7.75（1H，m，H-4），7.73（1H，d，J= 2.1 Hz，H - 5），7.40（1H，d，J= 7.4 Hz，H - 2），2.46（3H，s，CH3）。13C - NMR（DMSO -d6，400 Hz）δ：164.3（C - 1），124.2（C - 2），138.9（C - 3），119.5（C -4），118.5（C - 5），137.8（C - 6），124.7（C - 7），161.9（C-8），193.1（C-9），181.7（C-10），133.2（C-4a），118.9（C - 8a），118.7（C - 1a），135.6（C - 5a），23.5（- CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］的報道一致，故鑒定化合物9為大黃酚。

2.3 體外抗結(jié)腸癌活性篩選

采用MTT法檢測化合物1-9對SW480和HT-29細(xì)胞生長的抑制作用［14］。取9個化合物及5-FU適量，分別以DMSO 溶解，并配成濃度為200 mmol/ L 的母液，加DMEM 培養(yǎng)液稀釋，分別配成濃度為200.0，100.0，50.0，25.0，12.5，6.3 μmol/L 的含藥培養(yǎng)液。取SW480和HT - 29 細(xì)胞，加入含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)液（含雙抗），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取細(xì)胞適量，調(diào)細(xì)胞密度為5 × 103個/ 孔，接種于96孔板（每孔100 μL），以上述含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)3 d 后，棄去上清液，每孔加入5 g/ L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，以酶標(biāo)儀測定570 nm 波長處各孔的吸光度（OD）值，并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。實驗另設(shè)DMSO對照（等體積含1‰DMSO 的完全培養(yǎng)基）及空白對照（等體積不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基）；均設(shè)6 個復(fù)孔。結(jié)果見表1。

表1 9個化合物的IC50（μmol/L，n=6）Tab.1 IC50 of nine compounds（μmol/L，n=6）

結(jié)果表明，化合物1 在高濃度（≥100.4 μmol/ L）時表現(xiàn)出一定的腫瘤細(xì)胞抑制活性，但與5-FU相比不顯著（P＞0.05）；化合物2在中高濃度（≥26.5 μmol/L）時對SW480和HT-29細(xì)胞的生長具有顯著抑制作用；而化合物3，4，5，6，7，8，9幾乎未顯示抑制腫瘤細(xì)胞的活性。

3 討論

白花蛇舌草作為臨床常用抗結(jié)腸癌中草藥［15］，藥理及藥物化學(xué)研究相對豐富，中外學(xué)者從中分離并鑒定出上百個化合物，包括黃酮類、蒽醌類及環(huán)烯醚萜類［16］，但未見對分離得到的單體進行抗結(jié)腸癌活性篩選的報道。本研究中對白花蛇舌草有效部位進行分離、純化，提取并鑒定出的化合物2，6，7，8（白樺脂酸、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素）為從該植物中首次分離得到，經(jīng)初步考察發(fā)現(xiàn)，化合物齊墩果酸和白樺脂酸對SW480和HT-29 細(xì)胞的生長有一定抑制作用，尤其是白樺脂酸在中高濃度時對腫瘤細(xì)胞的生長有顯著抑制作用。白樺脂酸為有抗癌前景的天然產(chǎn)物，其作用包括直接殺傷腫瘤細(xì)胞，激活腫瘤細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡，增強機體的免疫功能以殺傷腫瘤細(xì)胞，以及作為抑癌增效劑，在聯(lián)合化療中避免MDR的產(chǎn)生，增強抗腫瘤藥的治療效果，但其抗結(jié)腸癌活性未見報道，本研究中初步揭示其抗結(jié)腸癌活性，其作用機制需深入研究［17-18］。本研究中初步探明了白花蛇舌草抗結(jié)腸癌的部分物質(zhì)基礎(chǔ)，可為其抗結(jié)腸癌的藥理作用研究及后續(xù)開發(fā)提供參考。