復(fù)方?jīng)]食子軟膏抗過(guò)敏、止癢、抗炎作用研究*

馬 璇，郝 夢(mèng)，陳 星，李建德，石雪韜，李亞杰，聶繼紅

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000； 2. 新疆中藥＜民族藥＞制藥共性關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011； 3. 新奇康藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011； 4. 新疆奇沐醫(yī)藥研究院＜有限公司＞，新疆 烏魯木齊 830011； 5. 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011； 6. 新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830099）

變態(tài)反應(yīng)性皮膚病目前主要以激素類(lèi)藥物治療，雖起效快、療效明顯，但常伴隨停藥易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性，甚至出現(xiàn)影響機(jī)體免疫功能、皮膚粗糙、色素沉著等藥品不良反應(yīng)［1-2］。故臨床常結(jié)合中醫(yī)治療，而中醫(yī)治療該病的外用藥物較少，單味藥材常療效不確切，需篩選安全有效的復(fù)方外用制劑［3-4］。復(fù)方?jīng)]食子軟膏為維吾爾藥，處方源于新疆喀什地區(qū)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒、燥濕收斂、清瀉機(jī)體局部異常黏液質(zhì)的功效，對(duì)濕疹等變態(tài)反應(yīng)性皮膚疾病的療效顯著。本課題組前期已證實(shí)其治療濕疹效果良好，其作用機(jī)制可能與影響TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)［5］。本研究中從該方功效出發(fā)對(duì)其進(jìn)行了抗過(guò)敏、止癢及抗炎方面的次要藥效學(xué)研究，為其新藥開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：CD-SC/SCT 型數(shù)顯游標(biāo)卡尺（上海首豐精密儀器有限公司）；MS104TS / 02 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；RM2125RTS 型病理切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

試藥：復(fù)方?jīng)]食子軟膏（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.5%，7%，14%，批號(hào)分別為20210325，20201230，20210410），賦形劑（批號(hào)為20210326），均購(gòu)自新奇康藥業(yè)股份有限公司；0.1%丁酸氫化可的松乳膏（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20061015）；復(fù)方醋酸地塞米松軟膏（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為2011016S）；2，4-二硝基氯苯（DNCB，上海九鼎化學(xué)科技有限公司，批號(hào)為97 - 00 - 7）；4 - 氨基吡啶（4 - AP，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為1063056）；右旋糖酐- 40（江西瑞威爾生物科技有限公司，批號(hào)為9004-54-0）；二甲苯（西格瑪奧德里奇＜上海＞貿(mào)易有限公司，批號(hào)為534056）。

動(dòng)物：SPF 級(jí)KM 小鼠250 只，4～5 周齡，體質(zhì)量14～16 g，均購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（新）2021- 0004。于溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，換氣頻率不少于每小時(shí)15次，人工光照12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水條件下進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究方案符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 方法

1.2.1 抗過(guò)敏作用

實(shí)驗(yàn)前1天于小鼠腹部脫毛（約2 cm×2 cm）。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，用50 μL 7%DNCB丙酮-橄欖油溶液（3∶1，V/V）于小鼠腹部致敏1 次，次日重復(fù)致敏1 次。實(shí)驗(yàn)第5，8，11，14，17 天，以20 μL 0.5% DNCB 丙酮橄欖油溶液于小鼠右耳內(nèi)外側(cè)行多次激發(fā)。11 d 后，以小鼠右耳出現(xiàn)紅腫、肥大、結(jié)痂等病變癥狀為建模成功。取建模成功的小鼠60只，分為模型組（等體積生理鹽水），陽(yáng)性藥物組（0.1%丁酸氫化可的松乳膏0.1g），賦形劑組（復(fù)方?jīng)]食子軟膏基質(zhì)0.1 g）及復(fù)方?jīng)]食子軟膏低、中、高劑量組（3.5%，7%，14%復(fù)方?jīng)]食子軟膏各0.1 g），各10 只；另取10 只小鼠設(shè)為正常對(duì)照組（等體積生理鹽水）。建模成功后，各組小鼠開(kāi)始給予相應(yīng)藥物或生理鹽水，每天1 次，連續(xù)7 d。每次激發(fā)5 h 后，測(cè)量小鼠左右耳中部厚度，計(jì)算耳腫脹度，平行3 次，耳腫脹度（%）=（右耳厚度-左耳厚度）×100%。末次激發(fā)24 h后，處死小鼠，收集脾臟和胸腺，精密稱(chēng)定，計(jì)算脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)，臟器系數(shù)=脾臟（胸腺）質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。取小鼠右耳耳廓組織，用10%甲醛組織固定液固定76 h以上，常規(guī)包埋，切片（厚3 μm），以蘇木素-伊紅（HE）及甲苯胺藍(lán)染色，觀察小鼠耳廓組織炎性反應(yīng)，并進(jìn)行病理半定量分級(jí)（參考標(biāo)準(zhǔn)，- 表示皮膚組織正常，組織結(jié)構(gòu)完整；+表示表皮無(wú)明顯變化，真皮上部偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；+ +表示表皮少量灶性細(xì)胞水腫，真皮上部少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；+ + + 表示表皮明顯灶性細(xì)胞水腫，真皮上部適量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；+ + + + 表示表皮大量灶性細(xì)胞水腫，真皮上部大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；+ + + + + 表示表皮網(wǎng)狀性病變，真皮上部眾多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。分別計(jì)為0，1，2，3，4，5分）。

1.2.2 止癢作用

4 - AP 致小鼠瘙癢：分組同1.2.1 項(xiàng)下方法，除陽(yáng)性藥物組予復(fù)方醋酸地塞米松軟膏0.1 g 外，其余組給藥不變。實(shí)驗(yàn)前1天于小鼠頸背部脫毛（約2 cm×2 cm）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，各組小鼠脫毛區(qū)予相應(yīng)藥物，每天2 次（間隔4 h），連續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，小鼠頸背部皮下注射1 mg / kg 的4-AP，立即觀察。以小鼠連續(xù)反復(fù)扭頭舔兩側(cè)背部致出現(xiàn)短暫停頓作舔體1次計(jì)，記錄30 min內(nèi)的小鼠舔體次數(shù)。

右旋糖酐- 40 致小鼠瘙癢：分組、脫毛、給藥同上述方法。末次給藥1 h 后，小鼠尾靜脈注射5 mL/ kg 0.02%右旋糖酐-40，立即觀察。以小鼠連續(xù)前爪抓頭部、后爪抓軀干或嘴咬全身部位致出現(xiàn)短暫停頓作瘙癢1次計(jì)，記錄30 min內(nèi)的小鼠抓撓次數(shù)。

1.2.3 抗炎作用

同1.2.2 項(xiàng)分組，于小鼠右耳涂抹相應(yīng)藥物，每天2 次，連續(xù)5 d。末次給藥1 h 后，用干棉簽擦除右耳殘留的藥物，并于小鼠右耳內(nèi)外側(cè)均勻涂抹二甲苯0.03 mL，30 min 后脫頸椎處死小鼠，用直徑8 mm 的打孔器分別打下小鼠左右耳廓相同部位，并立即稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算耳腫脹度。耳腫脹度（%）=（右耳質(zhì)量- 左耳質(zhì)量）/ 左耳質(zhì)量×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。采用單因素方差分析（ANOVA），先進(jìn)行組間總體均值比較，否則行組間多對(duì)一比較，方差齊時(shí)使用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)使用Tamhane′s T2 法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗過(guò)敏效果

與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方?jīng)]食子軟膏低、中、高劑量組小鼠給藥后第1，2，3次激發(fā)（第11，14，17天）耳腫脹度均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），詳見(jiàn)表1。各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠耳腫脹度比較（±s，%，n=10）Tab.1 Comparison of degree of ear swelling in each group（±s，%，n=10）

表1 各組小鼠耳腫脹度比較（±s，%，n=10）Tab.1 Comparison of degree of ear swelling in each group（±s，%，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表2至表4同。Note：Compared with those in the normal control group，#P ＜0.05，##P ＜0.01；Compared with those in the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Tab.1 - 2 and Tab.4）.

第17天-2.21±4.47 200.36±14.07##107.49±22.14**197.48±14.96##166.67±17.90**142.37±49.15**133.22±17.02**組別正常對(duì)照組模型組陽(yáng)性藥物組賦形劑組復(fù)方?jīng)]食子軟膏低劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏中劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏高劑量組劑量（mg/cm2）0.025 0.875 1.75 3.5第11天2.04±1.55 134.36±6.89##112.14±7.86**128.72±7.21##124.08±15.36*117.74±10.62**109.38±14.72**第14天0.17±2.64 194.21±6.84##108.27±23.80**189.66±15.31##169.25±15.78**150.96±16.40**141.53±10.72**

表2 各組小鼠臟器系數(shù)比較（±s，mg/g，n=10）Tab.2 Comparison of organ coefficient in each group（±s，mg/g，n=10）

表2 各組小鼠臟器系數(shù)比較（±s，mg/g，n=10）Tab.2 Comparison of organ coefficient in each group（±s，mg/g，n=10）

組別正常對(duì)照組模型組陽(yáng)性藥物組賦形劑組復(fù)方?jīng)]食子軟膏低劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏中劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏高劑量組劑量（mg/cm2）0.025 0.875 1.75 3.5脾臟系數(shù)2.76±0.50 3.75±1.04 1.15±0.28**4.88±2.88 3.44±0.82 3.22±0.58 3.42±7.23胸腺系數(shù)2.90±0.89 3.65±1.08 0.78±0.23**2.81±0.87 3.13±0.92 3.39±1.11 3.20±2.27

正常對(duì)照組小鼠耳片組織角質(zhì)層、表皮層、真皮層均正常。與正常對(duì)照組比較，模型組及賦形劑組小鼠耳片組織角化過(guò)度、顆粒層肥厚、棘層肥厚，表皮明顯增厚。表皮/真皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞大量增加，伴隨水腫、血管擴(kuò)張充血。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方?jīng)]食子軟膏低、中、高劑量組小鼠耳廓組織角化過(guò)度、表皮增厚均有不同程度減輕，表皮/真皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，耳廓組織病理形態(tài)改善。結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。

圖1 各組小鼠耳廓組織病理形態(tài)（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology of auricle tissue in each group（HE，×200）

表3 各組小鼠耳廓組織病理學(xué)分級(jí)及評(píng)分（±s，n=10）Tab.3 Pathological grading and scoring of auricle tissue in each group（±s，n=10）

表3 各組小鼠耳廓組織病理學(xué)分級(jí)及評(píng)分（±s，n=10）Tab.3 Pathological grading and scoring of auricle tissue in each group（±s，n=10）

組別劑量（mg/cm2）級(jí)別（只）-10分值+ + + ++ ++ + + + ++ + +正常對(duì)照組模型組陽(yáng)性藥物組賦形劑組復(fù)方?jīng)]食子軟膏低劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏中劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏高劑量組0 0.025 0.875 1.75 3.5 0 0 0 0 0 0+0 1 3 1 1 2 2 0 0 2 2 4 3 3 0 0 2 2 0 0 0 0 4 2 1 1 3 4 0 5 1 4 4 2 1 4.20±1.17##2.60±1.36*3.50±1.43 3.30±1.55 3.00±1.48 2.90±1.37*

2.2 止癢效果

與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方?jīng)]食子軟膏低、中、高劑量組小鼠30 min 內(nèi)的舔體次數(shù)均顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），陽(yáng)性藥物組和復(fù)方?jīng)]食子軟膏中、高劑量組小鼠30 min 內(nèi)的抓撓次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）。詳見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠舔體次數(shù)、抓撓次數(shù)、耳腫脹度比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of licking times，scratching times and degree of ear swelling in each group（±s，n=10）

表4 各組小鼠舔體次數(shù)、抓撓次數(shù)、耳腫脹度比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of licking times，scratching times and degree of ear swelling in each group（±s，n=10）

劑量（mg/cm2）0.04組別模型組陽(yáng)性藥物組賦形劑組復(fù)方?jīng)]食子軟膏低劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏中劑量組復(fù)方?jīng)]食子軟膏高劑量組0.875 1.75 3.5舔體次數(shù)33.5±5.9 26.5±4.7*41.0±8.7 26.7±7.6*27.5±2.4**21.5±4.2**抓撓次數(shù)20.0±6.2 12.0±4.3**23.1±3.8 19.1±4.1 15.7±4.1**14.1±2.8**耳腫脹度（%）51.08±11.62 3.10±19.30**42.78±18.92 37.03±11.08*31.30±10.33**36.40±11.22*

2.3 抗炎效果

與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和復(fù)方?jīng)]食子軟膏低、中、高劑量組小鼠耳腫脹度均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。詳見(jiàn)表4。

3 討論

復(fù)方?jīng)]食子軟膏以紫草和沒(méi)食子為主要藥材，并輔以馬脂等藥用輔料，起到良好的清熱解毒、消腫抗炎、收斂止血、保濕潤(rùn)膚作用。沒(méi)食子是沒(méi)食子蜂科昆蟲(chóng)沒(méi)食子蜂幼蟲(chóng)寄生于殼斗科植物沒(méi)食子樹(shù)幼枝產(chǎn)生的蟲(chóng)癭，主要成分有鞣質(zhì)和沒(méi)食子酸等，具有抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗病毒等作用［6-7］。紫草是紫草科植物新疆紫草或內(nèi)蒙古紫草的干燥根，以萘醌類(lèi)、多糖類(lèi)等成分較多，具有抗炎、抗腫瘤、抑菌等作用［8］。馬脂為馬項(xiàng)上的皮下脂肪，煉油，冷卻所得，外用于皮膚具有良好的滋潤(rùn)保濕、促進(jìn)皸裂愈合、抗氧化等作用［9］。

復(fù)方?jīng)]食子軟膏中，沒(méi)食子酸是化學(xué)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的天然多酚類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎等藥理作用［10］。有研究表明，沒(méi)食子酸對(duì)蛋清性關(guān)節(jié)炎、右旋糖酐性關(guān)節(jié)炎、5-羥色胺性關(guān)節(jié)炎、甲醛性關(guān)節(jié)炎有明顯的抗炎作用［11］。沒(méi)食子酸對(duì)小鼠肥大細(xì)胞促炎因子腫瘤壞死因子- α（TNF - α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及過(guò)敏介質(zhì)組胺的抑制作用顯著，能緩解肥大細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性過(guò)敏反應(yīng)［12］。鞣花酸具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗突變、抗菌、抗過(guò)敏等多種藥理作用。有研究顯示，鞣花酸可顯著降低由脂多糖誘導(dǎo)的體內(nèi)內(nèi)毒素血癥模型小鼠的血清炎性細(xì)胞因子水平［13］。有研究表明，鞣花酸能顯著降低被動(dòng)皮膚過(guò)敏模型小鼠皮膚藍(lán)斑的光密度值；明顯拮抗過(guò)敏介質(zhì)組織胺所致小鼠毛細(xì)血管通透性增加；明顯抑制DNCB 所致小鼠遲發(fā)型皮膚過(guò)敏反應(yīng)；抑制磷酸組織胺引起的豚鼠致癢反應(yīng)［14］。紫草素是傳統(tǒng)中藥紫草中的一種萘醌類(lèi)化合物，具有抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合、抗菌、抗病毒等多種藥理作用［15］。紫草素可抑制小鼠皮損組織中P 物質(zhì)，神經(jīng)激肽受體1（NK-1R），細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，緩解濕疹小鼠皮膚損傷［16］。本研究中推測(cè)，沒(méi)食子酸、鞣花酸、紫草素等成分可能是復(fù)方?jīng)]食子軟膏抗過(guò)敏、止癢及抗炎的有效成分。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)又稱(chēng)為T(mén) 細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅳ型超敏反應(yīng)。DNCB 致小鼠耳腫脹是常見(jiàn)的遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停珼NCB 作為半抗原，初次接觸使機(jī)體致敏，再次接觸機(jī)體后24～72 h 后才會(huì)發(fā)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)，導(dǎo)致以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞變性壞死為特征的局部變態(tài)炎性反應(yīng)的發(fā)生［17-18］。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)建立DNCB 致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型，發(fā)現(xiàn)復(fù)方?jīng)]食子軟膏可顯著降低模型小鼠耳腫脹度和耳廓組織炎性浸潤(rùn)程度，具有明顯的抗過(guò)敏作用。

4-AP 為K+通道阻滯劑，通過(guò)阻斷K+通道，促使血管平滑肌細(xì)胞去極化，進(jìn)一步激活Ca2+通道，引起血管收縮，同時(shí)促使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺引起皮膚瘙癢，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)舔體反應(yīng)［19-20］。采用4 - AP 誘發(fā)小鼠舔體反應(yīng)，簡(jiǎn)單、快捷且高效。本研究結(jié)果表明，復(fù)方?jīng)]食子軟膏各劑量組小鼠30 min 內(nèi)舔體次數(shù)明顯減少，止癢作用明顯。右旋糖酐為葡萄糖聚合物，根據(jù)分子量大小可分為中分子、低分子和小分子3 類(lèi)。右旋糖酐- 40 屬低分子右旋糖酐，在體內(nèi)排泄緩慢且易形成蓄積，蓄積在體內(nèi)的大分子右旋糖酐自身具備抗原性或與體內(nèi)蛋白結(jié)合后獲得抗原性，進(jìn)而引起機(jī)體變態(tài)反應(yīng)，這可能是其致皮膚瘙癢的原因［21］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方?jīng)]食子軟膏中、高劑量組小鼠30 min 內(nèi)的抓撓次數(shù)均明顯減少，止癢效果良好。

DNCB 為常見(jiàn)的化學(xué)致炎物，可誘導(dǎo)組胺等炎性介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致局部毛細(xì)血管通透性增加、增加血漿滲出引起組織水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等急性炎性反應(yīng)［22］。DNCB的致炎機(jī)制與臨床常見(jiàn)的急性炎癥非常相似，在中藥新藥的研發(fā)過(guò)程中，常采用DNCB刺激小鼠耳部復(fù)制急性炎癥模型，以此評(píng)價(jià)藥物的抗炎作用［23］。在小鼠耳廓組織涂抹二甲苯可在短時(shí)間內(nèi)引起耳廓充血、水腫等急性炎性反應(yīng)，此方法操作簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快、成模率高，且成本低［18］。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方?jīng)]食子軟膏各劑量組小鼠耳腫脹度均明顯降低，表明該制劑抗炎作用明顯。

復(fù)方?jīng)]食子軟膏作為外用藥物，可通過(guò)皮膚的透皮吸收，直達(dá)病所，以治療濕疹等過(guò)敏性皮膚病。也可通過(guò)肌腠毛竅轉(zhuǎn)運(yùn)至全身，達(dá)到內(nèi)外共治的作用。相較內(nèi)服藥物，可有效地解決首過(guò)效應(yīng)和用藥依從性等問(wèn)題［24］。本研究中通過(guò)不同動(dòng)物模型，驗(yàn)證了復(fù)方?jīng)]食子軟膏局部外用給藥可起到良好的抗過(guò)敏、止癢、抗炎作用，為復(fù)方?jīng)]食子軟膏的新藥研發(fā)工作和臨床運(yùn)用提供了藥理學(xué)研究依據(jù)，但其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。