3 種三唑類藥物血藥濃度測定方法的建立*

林志燕，黃曉會

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海 200092）

近年來，真菌感染尤其是深部真菌感染嚴重威脅患者的健康，抗真菌藥物以三唑類在臨床應用廣泛且療效較好，代表藥物有氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等。但因其在吸收、分布、代謝、排泄等藥物代謝動力學（簡稱藥動學）方面的差異和藥物相互作用的影響，導致不同患者血藥濃度的個體差異較大。如腎功能不全或中樞神經系統真菌感染患者體內氟康唑的血藥濃度會顯著升高［1］。伏立康唑具有非線性藥動學特征，其量效關系難測［2］。泊沙康唑為第2 代三唑類抗真菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、安全性高等特點，但其藥動學的個體差異明顯［3-4］。臨床實踐表明，抗真菌藥物的血藥濃度和藥物的臨床療效及藥品不良反應相關，其治療藥物監測（TDM）結果可為臨床給藥方案的制訂提供指導［5］。本研究中建立了同時測定氟康唑、伏立康唑和泊沙康唑血藥濃度的超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法，以為臨床抗真菌藥物的合理使用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀，Agilent 6460 型三重四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）、B05.00 Masshunter色譜工作站（美國Agilent公司）。

1.2 試藥

氟康唑對照品（批號為100314 - 201906，含量99.8%），伊曲康唑對照品（批號為100631-201402，含量99.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；伏立康唑對照品（European Pharmacopoeia Reference Standard，批號Y0001395，含量99.9%）；泊沙康唑對照品（Panphy Chemicals Corporation 公司，批號171228 - 49 - 2，含量100%）；乙腈、甲醇、甲酸為質譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Agilent SB - C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為含0.1%甲酸的乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～2 min 時5%A→80%A，2～4 min時80%A→95%A，4～5 min時95%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。

質譜條件：ESI，正離子多反應監測（MRM）模式。干燥氣和霧化氣均為氮氣，干燥氣溫度320 ℃，干燥氣流量7 L/ min，霧化器壓力45 psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流量12 L/ min，毛細管電壓4 000 V，噴嘴電壓0 V。氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的MRM 參數見表1，二級全掃描質譜圖見圖1。

圖1 二級質譜圖A.Fluconazole B.Voriconazole C.Posaconazole D.ItraconazoleFig.1 Secondary mass spectrum

表1 4種三唑類化合物的MRM參數Tab.1 MRM parameters of four triazole compounds

2.2 溶液制備與血清樣品預處理

混合對照品溶液：分別稱取氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度分別為1 000，200，200 μg/mL 的混合對照品溶液。-20 ℃避光保存（下同）。

標準曲線工作液：取混合對照品溶液適量，加甲醇倍比稀釋，制成氟康唑質量濃度為7.812 5，15.625，31.25，62.5，125，250，500，1 000 μg/ mL，伏立康唑為1.562 5，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200 μg/mL，泊沙康唑為1.562 5，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200 μg/mL的標準曲線工作液。

質控工作液：同標準曲線工作液制備方法制備，氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑質量濃度分別為25，150，750 μg/mL，5，30，150 μg/mL，5，30，150 μg/mL。

內標溶液：稱取伊曲康唑對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成質量濃度為65 μg/mL的溶液。

血清樣品預處理：取血清樣品180 μL，置1.5 mL離心管中，加入內標溶液20 μL、甲醇400 μL，渦旋1 min，15 000 r/ min 離心10 min，取上清液，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

專屬性考察：精密吸取人空白血清樣品，以等體積甲醇替代內標溶液；取人空白血清樣品適量，加入混合對照品溶液；取給藥后人血清樣品，加入內標溶液，以上溶液均按2.2 項下血清樣品預處理方法處理。取上述溶液及混合對照品溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果空白血清在對應色譜峰保留時間內均無干擾峰，氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑和伊曲康唑的保留時間分別為1.578，2.198，2.485，2.887 min，方法專屬性良好。詳見圖2。

圖2 總離子流圖1.Fluconazole 2.Voriconazole 3.Posaconazole 4.ItraconazoleA.Blank serum B.Blank serum+mixed reference solution+internal standard solution C.Mixed reference solution+internal standard solution D.Test serum containing fluconazole+internal standard solution E.Test serum containing voriconazole+internal standard solution F.Test serum containing posaconazole+internal standard solutionFig.2 Total ion chromatograms

線性關系考察：精密吸取標準曲線工作液20 μL，加入內標溶液20 μL、人空白血漿160 μL ，渦旋混勻，再加甲醇400 μL，制成氟康唑質量濃度為0.781 25 ，1.562 5，3.125，6.25，12.5，25，50，1 00 μg/mL，伏立康唑為0.156 25，0.312 5，0.625，1.25，2.5，5，10，20 μg/mL，泊沙康唑為0.156 25，0.312 5，0.625，1.25，2.5，5，10，20 μg/mL 的標準曲線血清工作液。按2.2 項下血清樣品預處理方法處理，在按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、待測成分與內標峰面積比值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。詳見表2。

表2 線性關系考察結果（n=8）Tab.2 Results of the linear relation test（n=8）

定量限考察：分別精密量取2.2 項下3 種對照品溶液適量，倍比稀釋，并按2.1項下試驗條件進樣測定，以信噪比（S/N）為10∶1 時的待測成分質量濃度為定量限，結果氟康唑、伏立康唑和泊沙康唑分別為0.084，0.007，0.016 μg/mL。

準確度與精密度試驗：取2.2項下低、中、高質量濃度的混合質控工作液進樣分析，每個質量濃度平行制備5 份，進行標準曲線分析，將待測成分峰面積/ 內標峰面積的結果代入標準曲線，計算待測成分的質量濃度，以待測成分實測濃度/理論加入濃度的結果計算方法準確度。以同一日內測得的6次待測成分濃度計算日內精密度；連續測定3 d，計算日間精密度。結果各待測物的準確度最低為91.36%，最高為113.92%（n= 3），日內和日間精密度的RSD均小于10%，表明該方法準確度較高，精密度較好。詳見表3。

表3 3種化合物的準確度和精密度Tab.3 Accuracy and precision of three compounds

提取回收率與基質效應考察：取不同來源的空白血清，按2.2項下方法制備低、中、高質量濃度的混合質控樣品，前處理后按2.1 項下色譜條件進樣測定，將對照品與內標峰面積的比值記為A；用甲醇替代空白血清，加入內標溶液，將混合對照品稀釋為與A 中質量濃度相同的樣品，按2.1 項下試驗條件進樣分析，對照品與內標峰面積的比值記為B；空白血清預處理后加入混合對照品溶液制備得到與A中質量濃度相同的樣品，對照品和內標峰面積比值記為C。以A/C×100%計算各化合物的提取回收率，以C/B× 100%計算基質效應。結果顯示，氟康唑的提取回收率為81.99%～96.97%，RSD＜14.25%，基質效應為90.80%～119.94%，RSD＜14.06%；伏立康唑的提取回收率為85.19%～97.83%，RSD＜14.82%，基質效應為94.38%～117.81%，RSD＜13.89%；泊沙康唑的提取回收率為81.00%～93.76%，RSD＜14.21%，基質效應為95.65%～109.08%，RSD＜13.47%。

穩定性考察：考察血清樣品在- 80 ℃與室溫間反復凍融3 次的穩定性，血漿樣品在-80 ℃下放置30 d的穩定性，給藥后血清樣品在4 ℃進樣器中放置0，12，24，48 h 的穩定性，給藥后血清樣品在室溫放置0，6，12 h 的穩定性。結果的RSD均＜10%，表明血清樣品在上述條件下基本穩定。

2.4 血藥濃度測定

收集我院2020 年7 月至2022 年9 月因治療需要接受氟康唑（38例）、伏立康唑（48例）、泊沙康唑（14例）治療的患者。治療7 d 后，當日用藥前30 min 抽取患者靜脈血2 mL，按本研究中所建立的方法當日測定血清藥物濃度。結果見表4至表6。

表4 氟康唑血藥濃度測定結果（n=38）Tab.4 Results of blood - concentration determination of fluconazole（n=38）

表5 伏立康唑血藥濃度測定結果（n=48）Tab.5 Results of blood-concentration determination of voriconazole（n=48）

表6 泊沙康唑血藥濃度測定結果（n=14）Tab.6 Results of blood-concentration determination of posaconazole（n=14）

3 討論

目前報道的三唑類抗真菌藥物測定方法有微生物法和高效液相色譜法，微生物法準確度相對較低，高效液相色譜法分析周期較長。本研究中建立了同時測定人血清中3種三唑類抗真菌藥物（氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑）的UPLC-MS/MS 法，考慮到同位素內標價格昂貴，成本較高，故選擇伊曲康唑為內標，其色譜保留行為和質譜條件與待測物較接近，且信號穩定性好。采用甲醇沉淀蛋白的前處理方法，簡單快捷，且每個樣品分析時間僅需5 min，滿足臨床檢測高通量要求。臨床服用以上3 種藥物的患者均可采用本方法進行血藥濃度監測，無需切換試驗方法。方法學驗證結果顯示，該方法專屬性強、靈敏度高、準確穩定，適用于臨床血藥濃度的監測。

本研究中血藥濃度測定結果顯示，氟康唑和泊沙康唑檢測濃度均在所設線性范圍內，伏立康唑有2 例低于定量限。表明氟康唑、伏立康唑和泊沙康唑個體藥動學差異較大。

目前報道的各藥物的有效濃度范圍，氟康唑參考有效濃度范圍應超過20 μg/mL［6］，伏立康唑在各國指南中推薦的谷濃度下限范圍為0.5～2.0 μg/mL，上限范圍為4～6 μg/mL，目標范圍為1.0～5.5 μg/mL［7-11］，臨床研究和指南推薦，泊沙康唑用于預防侵襲性真菌感染時，穩態谷濃度應大于0.7 μg/mL，治療濃度應大于1.25 μg/ mL［12-16］。但以上血藥濃度參考范圍針對成人設置，關于兒童血藥濃度推薦范圍的相關研究較少。本研究結果顯示，38例患者中有21例氟康唑血藥濃度大于20 μg/mL，48例患者中有37例伏立康唑血藥濃度在0.5～6.0 μg/mL，14 例患者中有9 例泊沙康唑血藥濃度大于0.7 μg/mL，其中有5例大于1.25 μg/mL。

根據血藥濃度監測結果進行劑量調整是TDM 的重要內容，此外，在調整給藥劑量、發生藥品不良反應或療效欠佳、加用或停用可能發生相互作用的藥物時，還需再次進行TDM。對于臨床患者，維持有效的血藥濃度范圍能獲得較好的療效，并降低藥品不良反應發生率。因此有必要對使用氟康唑、伏立康唑和泊沙康唑治療的患者實施血藥濃度監測，以提高臨床療效，確保用藥安全。本研究不足之處在于臨床樣本較少，后續將進一步擴大樣本量，為臨床制訂個體化給藥方案提供參考。