高效液相色譜法測定復方黃芪健脾口服液中黃芪甲苷含量*

王 錚，呂益濤，蔣倩倩，滕澤學，強君麗

（甘肅省白銀市藥品檢驗檢測中心，甘肅 白銀 730900）

復方黃芪健脾口服液由黃芪、萊菔子、白術、山楂、山藥、桑葉、大棗等藥材組方，有益氣固表、健脾消食功效，對小兒脾胃虛弱引起的反復呼吸道感染、營養性貧血、厭食等病癥療效顯著。黃芪甲苷屬皂苷類成分，是制劑中君藥黃芪的主要成分，也是《中國藥典》2020 年版一部中黃芪中藥材的質量控制指標［1］，具有抗炎、抗肝纖維化、抗氧化、抗哮喘、降血糖、免疫調節、心肌保護等多重作用［2-3］，因此選取黃芪甲苷含量作為該口服液的質量控制指標。該制劑現行地方標準［4］所用薄層色譜法已不能有效滿足其質量控制，而《中國藥典》2020年版一部收載含黃芪的中藥成方制劑質量控制方法均改為高效液相色譜（HPLC）法。本研究中參考藥典中黃芪含量測定項下方法及文獻［5-14］，建立了測定復方黃芪健脾口服液中黃芪甲苷含量的高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC -ELSD）法，簡化了前處理步驟，縮短了測定周期，提高了檢驗結果的準確度，可為該制劑的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括CTO-10ASVP柱溫箱、LC-20AT 泵、SIL-20A 自動進樣器、AA-530空氣壓縮機、ELSD-LTⅡ蒸發光檢測器、CBM-20A控制器（日本Shimadzu 公司）；PL - FS 80T 型數控超聲波清洗器（東莞康士潔超聲波科技有限公司）；XPE -105DU型及EL204-IC型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度分別為0.01 mg和0.1 mg）；HHS - 4S 型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海市南陽儀器有限公司）。

1.2 試藥

復方黃芪健脾口服液（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號分別為20031，20033，20048）；黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110781 - 202118，含量96.8%）；大孔吸附樹脂D101（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號為C11417836）；甲醇、乙腈為色譜級，無水乙醇、氨水為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（34∶66，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；蒸發光散射檢測器漂移管溫度：40 ℃；壓縮空氣壓力：350 kPa。

2.2 溶液制備

取黃芪甲苷對照品12.53 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加80%甲醇制成質量濃度為0.485 2 mg/mL的對照品溶液。精密量取樣品20 mL，加氨水20 mL 后搖勻靜置5 min，通過D101 型大孔吸附樹脂（內徑為1.5 cm，柱高為20 cm），分別用氨試液100 mL，水100 mL，40%乙醇100 mL 洗脫，棄去洗脫液，用70%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加80%甲醇溶解，移至5 mL 容量瓶中，加80%甲醇定容，即得供試品溶液。按復方黃芪健脾口服液的處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗與專屬性試驗：取2.2 項下3 種溶液各20 μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處出現相應色譜峰，理論板數按黃芪甲苷峰計為25 870，分離度均大于1.5，基線分離良好；陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Astragaloside ⅣA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2 項下對照品溶液適量，加80%甲醇稀釋成每1 mL 中分別含0.048 5，0.121 3，0.242 6，0.363 9，0.485 2 mg 黃芪甲苷系列對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以黃芪甲苷進樣量（μg）的對數值（X）為橫坐標、峰面積的對數值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1.585 5X+ 4.264 5（r= 0.999 6，n= 5）。結果表明，黃芪甲苷進樣量在0.97～9.70 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限考察：取線性關系考察項下質量濃度為0.048 5 mg/mL的對照品溶液適量，加80%甲醇倍比稀釋，以信噪比（S/N）為10∶1 時待測成分質量濃度為定量限，結果黃芪甲苷的定量限為3.64 ng/mL。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果黃芪甲苷峰面積的RSD為0.56%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別在室溫下放置0，2，4，6，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果黃芪甲苷峰面積的RSD為1.82%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20031）適量，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果黃芪甲苷含量的平均值為34.50 μg/mL，RSD為1.20%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取樣品（批號為20031）10 mL，共9份，分別加入質量濃度為0.485 0 mg/mL 的對照品溶液0.6，0.7，0.8 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品各20 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。另取3 批樣品，按現行質量標準中樣品前處理方法制備，精密量取樣品50 mL，加入水飽和正丁醇30 mL 振搖，提取4 次，合并正丁醇液，加入氨試液40 mL 洗滌2 次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，加水5 mL溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂（內徑為1.5 cm，柱高為12 cm），加水50 mL、40%乙醇30 mL 洗脫，棄去洗脫液，用70%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇溶解殘渣后轉移至2 mL 容量瓶中，即得供試品溶液［4］，精密吸取4 μL 和8 μL，再取2.2項下對照品溶液2 μL 和4 μL，交叉點于同一硅膠G 薄層板，以氯仿-甲醇-水（13∶6∶2，V/V/V）10 ℃以下設置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，顯色，在530 nm 和700 nm 波長處測定供試品溶液和對照品溶液吸光度，計算黃芪甲苷含量。結果見表2。可見，HPLC-ELSD 法測定的結果精密度更高?，F行含量測定標準中規定黃芪甲苷的含量為不得少于20 μg/ mL，由測定結果可知，分析方法的改變對限度標準無影響。

表2 2種方法測定黃芪甲苷含量結果比較（n=3）Tab.2 Results of the content determination of astragaloside Ⅳby two methods（n=3）

3 討論

3.1 前處理過程優化

黃芪中黃芪甲苷的來源包括黃芪甲苷衍生物的轉化及游離的黃芪甲苷，兩者總和為黃芪甲苷的總含量。因此，黃芪中黃芪甲苷含量與黃芪甲苷衍生物轉化的程度有關，黃芪甲苷衍生物在堿的作用下被水解，轉化為游離黃芪甲苷，有利于準確測定黃芪甲苷的含量［15］。

賴先榮等［16］采用在供試品中加入NaOH 至體積分數為5%，然后加入水飽和正丁醇進行萃取，再依次加5%NaOH 溶液、水洗滌供試品，調節正丁醇溶液的酸堿度至中性的方式純化供試品。賈曉斌等［17］的研究結果表明，正丁醇萃取法和大孔吸附樹脂法純化后的指紋圖譜有一定差異，但黃芪總皂苷得率接近，表明2 種純化方法除去的雜質有一定差異。可知，除雜、純化過程的關鍵在于堿化溶液的使用、飽和正丁醇萃取及大孔樹脂吸附步驟。

在前處理時加入的氨水或氨試液，可將黃芪醇類皂苷酯氨解為黃芪甲苷［18］，使得黃芪甲苷從絡合態轉變為游離態［19-20］。本研究結果表明，氨水及氨試液洗脫可有效除去復方黃芪健脾口服液中的酸性雜質。由此，設計本試驗中直接將氨水與口服液充分混勻后用大孔樹脂柱分離，再用氨試液洗脫，與現行含量測定標準（萃取后用堿液對提取物進行洗脫處理）方法相比，省去了萃取這一不穩定步驟，前處理時間8 h 縮短至約3 h，不但提高了效率，同時也提高了供試品測定的準確度及精密度。

3.2 檢測器選擇

制劑現行地方標準中采用了薄層色譜法測定黃芪甲苷含量，步驟煩瑣，費時費力，僅供試品前處理就需耗時8 h 以上，且測定結果重復性差。ELSD 法幾乎無流動相溶劑干擾，對被測成分無特定的化學結構要求，尤其適用于黃芪甲苷此類無特定吸收波長，紫外末端吸收的情況，故2015 年版《中國藥典》以后收載的含中藥黃芪的中藥成方制劑質量控制方法均改用HPLC 法，測定結果準確可靠，重復性好。

3.3 方法評價

本研究中建立的HPLC-ELSD 法在前處理時簡化了原地方標準中供試品前處理步驟，將氨水直接與口服液混合后進行大孔吸附樹脂洗脫，省去了萃取步驟，大幅縮短了測定時間，操作簡便，且方法專屬性強，精密度高，重復性良好，可用于該產品的質量控制。