過濾速率對阿奇霉素干混懸劑微生物限度檢查方法的影響

姬 俊，牛萌萌，朱世真，劉婷婷，王立云，陳 靜

（1. 山東省青島市食品藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局海洋中藥質量研究與評價重點實驗室，山東 青島 266073； 2. 山東省青島市中醫醫院·青島市海慈醫院，山東 青島 266000）

阿奇霉素是氮雜類化合物，屬大環內酯類抗生素，2020 年版《中國藥典（二部）》收載的劑型有干混懸劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑及注射劑［1］，其中干混懸劑始載于2000 年版《中國藥典》。不同劑型阿奇霉素的微生物限度檢查方法多以離心后的上清液作為供試液［2-5］，或用含中和劑的稀釋液制備供試液［6］，再通過薄膜過濾法消除其強抑菌性。在采用薄膜過濾法探索阿奇霉素干混懸劑的需氧菌和控制菌限度檢查方法時，發現過濾速率影響微生物限度檢查方法適用性試驗結果，但《中國藥典》對其并無明確規定。因此本研究中根據2020年版《中國藥典（四部）》通則1105，1106［7］規定，對阿奇霉素干混懸劑進行方法適用性研究，建立了無離心、無中和劑的微生物限度檢查方法；同時也對薄膜過濾法中的沖洗液過濾速率與去除該藥抗菌性的關系進行初步探索，為薄膜過濾法試驗條件的改進提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與菌株

儀器：SHP-160 型生化培養箱、GNP-9160E 型隔水式培養箱（上海三發科學儀器有限公司）；INE500 型電熱恒溫培養箱（德國Memmert 公司）；HTY - 302G 型微生物限度檢驗儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）；TD型電子天平（余姚金諾天平儀器有限公司）；RH basic 2型磁力攪拌器（德國IKA公司）。

試藥：阿奇霉素干混懸劑［輝瑞制藥有限公司（HR），批號分別為DJ4557，DE7924，DK1763；黑龍江諾捷制藥有限責任公司（NJ），批號為1902334；石藥集團歐意藥業有限公司（SY），批號為063191021；山東綠因藥業有限公司（LY），批號為207220416；規格均為0.1 g］；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為20201124），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號為20201123），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號為20200628），麥康凱液體培養基（批號為20190211），pH 7.0 氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（批號為20210112），大豆卵磷脂（批號為20200901），均購自青島海博生物科技有限公司；沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號為20190630），麥康凱瓊脂培養基（批號為20190723），均購自青島日水生物技術有限公司；聚山梨酯80（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20201027）。

菌株：金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

取各菌株適量，依法制備濃度為≤104cfu / mL和≤102cfu/mL 的各試驗菌菌懸液［2］。取樣品10 g，用緩沖液（pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，下同）定容至100 mL，混勻，作為不含中和劑的1∶10（m∶V）供試液（供試液Ⅰ）；取適量，用緩沖液分別依次稀釋成1∶50（V∶V）、1∶100（V∶V）、1∶500（V∶V）不含中和劑的供試液（供試液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）。取樣品10 g，用含3%聚山梨酯80及0.3%大豆卵磷脂的緩沖液定容至100 mL，混勻，作為含中和劑的1∶10（V/V）供試液（供試液Ⅴ）。

1.2.2 微生物計數方法適用性試驗

1）需氧菌計數方法適用性試驗

試驗組1（前加菌）：在濾杯中加入緩沖液100 mL，加入1.2.1 項下供試液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ各1 mL，以及菌濃度≤102cfu/mL 的各需氧菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌）菌液1 mL，濾過，并用緩沖液沖洗濾膜，每次100 mL，共沖洗4次。

試驗組2（后加菌）：在濾杯中加入緩沖液100 mL，取1.2.1 項下供試液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ各1 mL，濾過，并用緩沖液沖洗濾膜，每次100 mL，共沖洗4次，末次沖洗時加入菌濃度≤102cfu/mL的各需氧菌菌液1 mL。

菌液對照組：以緩沖液代替供試液，以200 mL/min的過濾速率進行過濾。同相應試驗組操作。

供試液對照組：以0.9%無菌氯化鈉溶液代替菌液。同相應試驗組操作。

低速對照組：以緩沖液代替供試液，分別以100 mL/min或50 mL/min 的過濾速率進行過濾。同試驗組1 操作。用于需氧菌計數的濾膜置TSA 平皿上。將TSA 平皿置30～35 ℃培養箱，并每日計數。試驗組回收比=（試驗組平均菌落數-供試液對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數；低速對照組回收比= 低速對照組平均菌落數/菌液對照組平均菌落數。

方法：分別以不同過濾速率沖洗試驗組1 及試驗組2的濾膜，過濾速率分別約為200，100，50 mL/min。

2）霉菌和酵母菌計數方法適用性試驗

試驗組3：取1.2.1 項下供試液Ⅰ10 mL，置無菌試管中，并分別加入菌濃度≤104cfu/ mL 的白色念珠菌菌液或黑曲霉孢子懸液0.1 mL，混勻。

菌液對照組：以緩沖液代替供試液。同試驗組3操作。

供試液對照組：以0.9%無菌氯化鈉溶液代替菌液。同試驗組3操作。

方法：取含菌供試液各2 mL，置平皿中，每日1 mL，倒入溫度≤45 ℃的SDA。將用于霉菌和酵母菌計數的平皿置20～25 ℃培養箱中，并每日計數。

1.2.3 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法適用性試驗

試驗組1（直接接種法）：取1.2.1項下供試液Ⅰ10 mL，加入TSB中，混勻。

試驗組2（直接接種法）：取1.2.1項下供試液Ⅴ10 mL，加入含3%聚山梨酯80及0.3%大豆卵磷脂的TSB中。

試驗組3（薄膜過濾法）：取緩沖液100 mL，共5 份，分別加入1.2.1 項下供試液Ⅴ2 mL，搖勻，將含藥緩沖液全部加至濾杯中，過濾，用緩沖液沖洗濾膜，每次100 mL，每張濾膜沖洗5次。5張濾膜置同一TSB中。

菌液對照組：以緩沖液代替供試液，同相應試驗組操作。試驗組3 的菌液對照組以150 mL/min 的過濾速率進行過濾。

供試液對照組：以0.9%無菌氯化鈉溶液代替菌液。同相應試驗組操作。

低速對照組：以緩沖液代替供試液，分別以100 mL/min或50 mL/min的過濾速率進行過濾。同試驗組3操作。

陰性對照組：以緩沖液代替供試液，以0.9%無菌氯化鈉溶液代替菌液。同相應試驗組操作。

方法：設增菌培養基體積分別為200，500，700，1 000 mL，并在加入供試液或濾膜后向培養基中分別加入菌濃度≤102cfu/ mL 的大腸埃希菌，考察不同體積增菌培養基對大腸埃希菌檢查方法適用性試驗的影響。過濾速率分別設為150，100，50 mL/min，試驗組3考察沖洗液的不同過濾速率對大腸埃希菌檢出的影響。將以上含菌培養基置30～35 ℃培養箱中培養24 h。取培養物各1 mL，加入100 mL麥康凱液體培養基中，置42～44 ℃培養箱中培養24 h。用無菌接種環將麥康凱液體培養基培養物劃線接種至麥康凱瓊脂培養基平皿上，置30～35 ℃培養箱中培養24 h。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌計數方法適用性試驗

用受抑制最大的金黃色葡萄球菌進行試驗，確定需氧菌計數方法。當沖洗液過濾速率為50 mL/min 時，試驗組1 的3 批供試液Ⅳ（HR）的金黃色葡萄球菌回收比均為0.5～2.0，試驗組2 僅1 批供試液Ⅲ（HR）的回收比為0.5～2.0。詳見表1、表2。

表1 前加菌薄膜過濾法金黃色葡萄球菌的回收試驗結果（n=3）Tab.1 Results of the recovery test of Staphylococcus aureus by the membrane filtration method with bacteria-addition before filtration（n=3）

表2 后加菌薄膜過濾法金黃色葡萄球菌的回收試驗結果（n=3）Tab.2 Results of the recovery test of Staphylococcus aureus by the membrane filtration method with bacteria-addition after filtration（n=3）

2.2 需氧菌低速對照組各試驗菌的回收結果

按試驗組1（前加菌）方法，當沖洗液過濾速率為50 mL/min 或100 mL/min 時，低速對照組各試驗菌的回收比均為0.5～2.0。詳見表3。

表3 前加菌需氧菌低速對照組的回收試驗結果（n=3）Tab.3 Results of the recovery test of low-filtration-rate control group of aerobic bacteria by bacteria-addition before filtration（n=3）

2.3 需氧菌計數方法的確定

根據表1 至表3 結果，確定樣品（HR）需氧菌計數方法采用薄膜過濾法（試驗組1，前加菌），過濾速率為50 mL/min，取1∶500（V/V）供試液1 mL 進行試驗。

2.4 其他需氧菌計數方法適用性試驗結果

根據確認的需氧菌計數方法對其他需氧菌計數方法進行適用性試驗，回收比均為0.5～2.0；3 批樣品（HR）按平皿法操作，霉菌和酵母菌的回收比也均為0.5～2.0，符合藥典要求。詳見表4。

表4 微生物計數方法適用性試驗結果（n=3）Tab.4 Results of the suitability test for microbial counting method（n=3）

2.5 控制菌（大腸埃希菌）限度檢查方法適用性試驗結果

樣品（HR）控制菌檢查可聯用薄膜過濾法（5 張濾膜）和培養基稀釋法，過濾速率為50 mL/min，增菌培養基體積為700 mL。詳見表5、表6。

表5 控制菌檢查方法適用性試驗（直接接種法）結果Tab.5 Results of the suitability test for specified microorganism test（direct inoculation）

表6 控制菌檢查方法適用性試驗（薄膜過濾法）結果Tab.6 Results of the suitability test for specified microorganism test（membrane filtration）

2.6 其他企業微生物限度檢查方法適用性試驗結果

根據3 批樣品（HR）確定的微生物限度檢查方法，對另外3 家企業的樣品進行關鍵菌微生物限度檢查方法適用性試驗，金黃色葡萄球菌的計數采用薄膜過濾法（試驗組1，前加菌），過濾速率為50 mL/min，取不同稀釋度供試液1 mL進行試驗。詳見表7。控制菌（大腸埃希菌）檢查聯用薄膜過濾法（5 張濾膜）和稀釋法，過濾速率為50 mL/min，增菌培養基體積為200～1 200 mL。

表7 其他樣品微生物限度檢查方法適用性試驗結果Tab.7 Results of the suitability test of microbial limit test for other samples

3 討論

抗生素類藥物在確定微生物限度檢查方法時，為消除抑菌性，常采用薄膜過濾法、添加中和劑、增加稀釋液或培養基體積及聯用上述方法［7-10］。阿奇霉素干混懸劑具有較強抑菌活性，以常規緩沖液作為稀釋液和沖洗液，采用200 mL/ min 過濾速率進行薄膜過濾時，無法消除其對金黃色葡萄球菌的抗菌活性；用直接接種法進行控制菌檢驗時，在供試液和增菌培養基中加入常用中和劑［11-12］，也無法消除其對大腸埃希菌的抑制作用。本研究中通過降低薄膜過濾法的過濾速率，并聯用多種方法，降低該藥的抑菌性，使其需氧菌和控制菌的限度檢查方法適用性試驗結果符合藥典規定。

阿奇霉素不溶于水、脂溶性高、呈弱堿性、味苦，將其制成干混懸劑，可遮蓋苦味使其易于吞咽，且干混懸劑還具有易分裝、胃腸道刺激性小、易吸收等優點［13］。分析低速過濾可使微生物限度結果符合要求的原因，可能與該藥輔料的溶解有關，如阿奇霉素干混懸劑樣品（HR）的輔料為蔗糖、無水磷酸三鈉、羥丙基纖維素、合成生物聚合膠、香精，低速過濾使水溶性輔料溶解時間延長，輔料溶解后，有抑菌作用的阿奇霉素也隨沖洗液被沖洗過濾掉；而用相對高的速率沖洗時，不利于水溶性輔料的溶解，未溶解的輔料和抑菌藥物仍殘留在濾膜上，當濾膜移至培養基，輔料會進一步溶解，暴露出來的阿奇霉素作用于微生物，導致結果不符合要求。

本研究中進行需氧菌計數方法適用性試驗時，為得到更高稀釋度的試驗方法，又采用后加菌的方式進行薄膜過濾試驗，雖然后加菌的供試液Ⅲ回收試驗結果較前加菌試驗高，但3 批樣品（HR）回收比并未全部達到0.5，因此依據前后加菌試驗的結果，確定以前加菌的方式進行需氧菌的薄膜過濾試驗。采用薄膜過濾法進行控制菌檢驗時，將混勻的10 mL供試液Ⅰ直接加至1 個濾杯或平分加入2 個濾杯中進行過濾時，樣品的顆粒會堵塞濾膜；當將供試液分成5 份，每份2 mL，分別加至5 個濾杯中進行過濾時，濾膜未堵塞，但因加入藥量較計數試驗時多，最大過濾速率也相應降低（由計數試驗的200 mL/ min 降至150 mL/ min）。因此，將供試液分于多張濾膜過濾，使每張濾膜上的樣品量減少；用低速（50 mL/min）分別對其進行沖洗，進一步降低每張濾膜上的抑菌成分；并將濾膜置增加的培養基中，即聯用多種方法去除樣品對大腸埃希菌的抑菌性。

薄膜過濾法是用沖洗液將濾膜上殘留的藥物沖洗過濾掉，減少或消除濾膜上抗菌藥物及其抑菌性。藥典對薄膜過濾法的濾膜、沖洗量等因素均作了明確規定［7］，但對過濾速率并未要求。近年來，隨著抗生素微生物限度檢查方法研究的深入，薄膜過濾法的應用也在不斷發展，包括發明雙濾膜過濾法防止濾膜堵塞［14］及通過增加濾膜數量的方式增加沖洗量［15］，但對薄膜過濾速率的研究較少。本研究中通過對阿奇霉素干混懸劑需氧菌、控制菌限度檢查方法的研究，證明薄膜過濾法的沖洗液流速影響微生物的計數回收結果和控制菌的檢出，低流速在不影響試驗菌回收的情況下，增加了藥物中水溶性成分的溶解時間，使其與抑菌藥物相繼被沖洗掉，且流速越低對藥物抑菌性的消除作用越強。故本研究結果為完善薄膜過濾試驗條件、增加去除抗菌藥物的方法及相關研究提供了依據和新思路。