基于PI3K/Akt 通路探討鹿茸促進下肢動脈硬化閉塞癥大鼠血管新生的作用機理?

李子娟，王雁彬，韓 杰，張曉園，李廷荃△

1 山西中醫藥大學中醫臨床學院，山西 太原 030024；2 山西中醫藥大學附屬醫院，山西 太原 030024； 3 山西省中醫院，山西 太原 030000

下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans of the lower extremities，ASOLE）是指由于動脈硬化造成的內膜增厚、管腔狹窄或閉塞，導致相應區域供血不足的一系列疾病，主要表現為下肢皮溫降低、間歇性跛行、疼痛，易引起肢體末端壞疽，導致截肢［1-2］。鹿茸具有補腎、填精、益髓的功效［3］，前期研究表明，鹿茸能夠促進ASOLE大鼠血管新生［4］，但具體機制尚未明晰。磷脂酰肌醇3-羥基激酶（phosphatidy linositol 3-hydroxykinase，PI3K）是蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的上游信號分子，可通過激活Akt 來調節細胞內信號通路和細胞功能變化，在血管新生中發揮重要作用［5-6］。本實驗通過檢測ASOLE模型大鼠血清中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、缺氧誘導因子1α多肽（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）的含量以及骨髓中EPCs 凋亡率與腓腸肌中血管內皮細胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）的陽性表達探討鹿茸通過PI3K/Akt信號通路促進ASOLE大鼠血管新生的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級雄性SD 大鼠92 只，2 月齡，體質量250～300 g，由山西省中醫藥研究院提供，實驗動物質量合格證號：1103221911003889。

1.2 飼料制備高脂飼料（80.3%基礎飼料、15%豬油、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、4%膽固醇）。

1.3 藥物與試劑鹿茸采用馬鹿茸，購自北京同仁堂（集團）有限責任公司，用普通粉碎機粗粉后再用氣流超微粉碎機制成微粉（粒徑＞10 μm），溫水調，攪拌均勻，即用即配。PI3K抑制劑LY294002購于美國Selleck公司中國分公司（美國輝瑞公司授權經銷商），用DMSO 配置母液（10 mg LY294002溶于6.5075 mL DMSO），于-20 ℃冰箱保存，每日配置當日所需溶液（10%母液+40%PEG300+5%Tween-80+45%生理鹽水），即用即配；維生素D3針劑（哈爾濱摩天農科獸藥有限責任公司，批號：20190318）；ELISA試劑盒（Elabscience 公司，貨號E-EL-R2603c）；VEGF抗體、HIF-1α抗體（abcam公司，貨號：145056）；TUNEL 試劑盒（凱基生物科技有限公司，批號：20200623）。

1.4 儀器微型高速離心機（Labnet 公司，美國）；電熱恒溫培養箱（ASONE 公司，日本）；全自動酶標儀（Thermo scientific 公司，美國）；顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）；切片機（萊卡公司，德國）；離心機（北京離心機廠）；電子天平（METTER 公司，瑞士）；移液器（EPPENDORF 公司德國）；干燥箱、低溫冰箱（三洋公司，日本）；恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠）；醫用微波爐（浙江臨安愛迪儀器廠）；脫水機、包埋機、凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（上海徠卡科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 分組 采用隨機數字表法將大鼠分為正常組、模型組，每組10 只，鹿茸低、中、高劑量組及LY294002+鹿茸低、中、高劑量組，每組12只。

1.5.2 下肢動脈硬化閉塞癥模型制作 1）將大鼠以5%水合氯醛溶液（7 mL/kg）腹腔麻醉，隨后取平臥位，固定于手術臺，左側腹股溝備皮；2）碘伏消毒左側腹股溝區域后，行一長約1.5 cm 縱切口，暴露血管鞘，分離股動脈及其分支，齒鑷沿股動脈走形鉗夾約30 s，分別結扎并離斷左側股動脈分支；3）用0 號線縫合皮下組織及皮膚，背部皮下注射生理鹽水10 mL 補液抗休克治療，大鼠各項生命體征平穩后放回鼠籠；4）30萬單位青霉素肌肉注射3天預防感染；5）高脂飼料喂養12周；6）予維生素D3（30萬U/kg）右下肢肌肉注射，每月1次［7］。

1.5.3 給藥方法 鹿茸低、中、高計量組分別灌胃［0.143、0.286、0.572 g/（kg·d）］鹿茸溶液。LY294002 組腹腔注射LY294002［1 mg/（kg·d）］；正常組、模型組及假手術組灌胃等容量蒸餾水。LY294002+鹿茸低、中、高計量組先腹腔注射LY294002 再灌胃鹿茸溶液。于造模第一天開始給藥，每日1次，28天后處死大鼠。

1.5.4 標本采集及處理方法 將大鼠麻醉后，用小鑷子摘去一只眼球，收集外周血到EP 管中；取大鼠術側下肢腓腸肌，立即凍存于液氮中，并存儲于-70 ℃冰箱待用。

1.6 檢測指標

1.6.1 一般狀態 觀察大鼠一般狀態，包括精神狀態、毛色、皮溫及活動靈敏度等。

1.6.2 大鼠外周血清中VEGF、HIF-1α含量ELISA檢測 實驗開始前，各試劑均平衡至室溫；試劑或樣品配制時需充分混勻，并盡量避免起泡；分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品或樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL。給酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去孔內液體，甩干，不洗板，每孔中加入生物素抗體溶液100 μL，酶標板加覆膜，37 ℃溫育1 h；棄去液體，洗板3次，每次浸泡30 s，大約350 μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；每孔加酶結合物溶液100 μL，加覆膜，37 ℃溫育30 min；棄去孔內液體，甩干，洗板5次；每孔加底物溶液（TMB）90 μL，酶標板加覆膜37 ℃避光孵育15 min 左右。當標準孔出現明顯梯度時每孔加終止液50 μL，終止反應；立即用酶標儀在450 nm 波長處測量各孔光密度（OD值）。

1.6.3 骨髓中EPCs 凋亡率TUNEL 檢測 標本經分層離心涂片后：1）4%多聚甲醛固定30 min；樣本 片 浸 入PBS 漂 洗3 次，每 次5 min；2）配 置1%Triton X-100 通透液，將樣本片浸入通透液中，室溫促滲3～5 min；之后浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；3）配置3% H2O2封閉液，樣本片浸入封閉液中，室溫（15～25 ℃）封閉10 min；樣本片浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；4）配置TdT 酶反應液，每個樣本滴加50 μL TdT酶反應液，加蓋玻片放入溫盒中，37 ℃避光反應30 min；反應后得樣片浸入PBS 漂洗3 次，每次5 min；5）每個樣本滴加50 μL 避光配置的Streptavidin-HRP 溶液，37 ℃避光反應30 min；反應后的樣片浸入PBS漂洗3 次，每次5 min；6）配置DAB 溶液顯色；7）蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片后熒光顯微鏡下觀察；每例切片計數5 個200 倍視野，以平均每100個細胞中所含凋亡細胞個數計算凋亡率。

1.6.4 腓腸肌中VEGFR含量免疫熒光技術檢測 涂片后用多聚甲醛固定10 min；用PBS 溶液微振蕩洗滌5 min×2次。加0.4% Triton-X100破膜5～10 min，用PBS 微振蕩洗滌3 min×3 次；用1%PBS封閉液室溫封閉30 min～1 h；用0.5% PBS 稀釋一抗，比例為1∶100；4 ℃過夜；從冰箱拿出后37 ℃復溫45 min；或室溫2～3 h；或37 ℃ 1 h；孵育后用PBS 微振蕩洗滌5 min×3 次；用0.5%PBS稀釋二抗，比例為1∶400；室溫30 min 1 h；孵育后用PBS 微振蕩洗滌5 min×3 次；DAPI 原液為1 g/mL，稀釋濃度為1∶1000，快速染色10 s，用蒸餾水沖洗；用防淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.7 統計學方法應用SPSS 25.0 分析數據，計量資料以表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態空白組、假手術組大鼠精神良好，毛色光澤，活動靈敏，下肢溫度正常；模型組、各給藥組大鼠最初1 個月增長迅速，后增長減緩，且精神萎靡，活動欠靈敏，毛色暗淡，下肢溫度降低。

2.2 外周血清中VEGF與HlF-1α含量與空白組相比，模型組及各給藥組VEGF及HIF-1α水平降低（P＜0.01），各給藥組VEGF 及HIF-1α水平高于模型組（P＜0.01）；其中鹿茸高劑量組最顯著，且高于鹿茸高劑量+LY294002 組（P＜0.01）；鹿茸高劑量+LY294002組高于鹿茸中劑量組（P＜0.05）；鹿茸中劑量組高于鹿茸中劑量+LY294002組（P＜0.05）；鹿茸中劑量+LY294002 組高于鹿茸低劑量組（P＜0.05）；鹿茸低劑量組高于鹿茸低劑量+LY294002組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠外周血清中VEGF、HlF-1α含量（）

表1 各組大鼠外周血清中VEGF、HlF-1α含量（）

注：與空白組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；與模型組比較，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05；與鹿茸高劑量組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

HIF-1α 51.73±3.61△△*41.11±4.01▲△△34.39±0.37▲▲△△**32.96±0.44▲▲△△*28.09±1.87▲▲△△**24.03±0.82▲▲△△**21.52±0.94▲▲△**18.84±1.27▲▲**組別空白組鹿茸高劑量組鹿茸高劑量+LY294002組鹿茸中劑量組鹿茸中劑量+LY294002組鹿茸低劑量組鹿茸低劑量+LY294002組模型組鼠數6 6 6 6 6 6 6 6 VEGF 111.35±7.69△△**85.56±4.65▲▲△△72.78±0.98▲▲△△**67.55±2.29▲▲△△**61.97±0.79▲▲△△**59.16±0.78▲▲△△**54.22±0.99▲▲△△**50.85±0.18▲▲**

2.3 骨髓中EPCs 凋亡率 與空白組及各給藥組比較，模型組骨髓EPCs 凋亡率上升（P＜0.01）；與空白組相比，鹿茸高劑量組骨髓中EPCs凋亡率無顯著差異（P＞0.05），其中鹿茸高劑量組低于鹿茸高劑量+LY294002組（P＜0.05），鹿茸高劑量+LY294002組低于鹿茸中劑量組（P＜0.01），鹿茸中劑量組低于鹿茸中劑量+LY294002組（P＜0.05），鹿茸中劑量+LY294002 組低于鹿茸低劑量組（P＜0.01），鹿茸低劑量組低于鹿茸低劑量+LY294002組（P＜0.01）。見表2。

表2 TUNEL檢測給藥后骨髓中EPCs凋亡率（）

表2 TUNEL檢測給藥后骨髓中EPCs凋亡率（）

注：與空白組比較，▲▲表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；與模型組比較，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05；與鹿茸高劑量組比較，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

EPCs凋亡率8.2±2.86△△7.8±2.59△△11.6±0.90▲△△*15.8±1.92▲▲△△**18.4±1.14▲▲△△**21.4±1.52▲▲△△**26.2±2.28▲▲△△**38.6±4.72▲▲**組別空白組鹿茸高劑量組鹿茸高劑量+LY294002組鹿茸中劑量組鹿茸中劑量+LY294002組鹿茸低劑量組鹿茸低劑量+LY294002組模型組鼠數55555555

2.4 腓腸肌中VEGFR 陽性表達 模型組及各給藥組VEGFR陽性表達低于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組VEGFR陽性表達升高（P＜0.05）；其中各給藥組VEGFR 陽性表達由高到低依次為鹿茸高劑量組、鹿茸高劑量+LY294002 組、鹿茸中劑量組、鹿茸中劑量+LY294002 組、鹿茸低劑量組、鹿茸低劑量+LY294002 組，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1—2。

圖1 免疫熒光法測定腓腸肌中VEGFR陽性表達比例

圖2 腓腸肌中VEGFR陽性表達（免疫熒光法）

3 討論

動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是由于血管動脈粥樣硬化斑塊的不斷擴大和繼發血栓引起動脈管腔狹窄甚至閉塞，出現患肢慢性或急性缺血癥狀［8-10］。因此，改善缺血區域血流灌注促進血管新生成為治療的重要步驟之一。現代研究認為，鹿茸可促進血液生成和運行，而鹿茸的主要成分鹿茸多肽對表皮細胞及成纖維細胞有促進增殖作用，可以加速瘡面愈合，促進血管內皮細胞增殖分化及遷移，促進病變部位血管生成［11］。

HIF-1α是維持內環境氧平衡的核心調控因子，調控一系列缺氧相關基因的表達，HIF-1α結合VEGF基因并啟動轉錄過程，最終導致VEGF在細胞內累積［12］，VEGF 是促進血管生成的重要因子，通過與內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）表面的VEGFR 結合，誘導下游促細胞存活相關通路激活，如PI3K/Akt信號通路，以促進EPCs 增殖［13-14］。EPCs 來源于骨髓，具有自我增殖和多向分化潛能，并可分化為血管內皮細胞，不僅參與胚胎時期血管新生，同時也在成人血管新生中發揮關鍵作用［15］。LY294002 是常見的PI3K/Akt信號通路阻斷劑，可完全抑制PI3K 磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt通路影響血管生成［16-17］。

本實驗結果顯示，大鼠血清中HIF-1α、VEGF含量以及腓腸肌中VEGFR 陽性表達鹿茸高劑量組最高，鹿茸中劑量組與鹿茸低劑量組依次降低，同時PI3K/Akt 抑制劑LY294002 組HIF-1α、VEGF 含量和VEGFR 陽性表達低于相應鹿茸劑量組；骨髓中EPCs 凋亡率鹿茸高劑量組最低，鹿茸中劑量與低劑量依次升高，含有LY294002組EPCs凋亡率高于同劑量對應組，表明使用LY294002 抑制劑組效果差于同劑量未使用LY294002 組，其差異有統計學意義（P＜0.05）。且鹿茸高劑量組效果優于其余各組，接近空白組水平。可見，鹿茸通過刺激PI3K/Akt 信號通路提高了HIF-1α、VEGF 表達，增加了VEGF 含量，VEGF 與VEGFR 結合，促進了EPCs細胞增殖，最終促進ASOLE 大鼠血管新生。而其具體機制還需通過PI3K/Akt 信號通路其余關鍵蛋白進行檢驗。