基于復雜網絡技術分析“北沙參-桔梗”治療放射性肺炎的機制?

馬思遙，任延毅，王雪冰

中國醫科大學腫瘤醫院/遼寧省腫瘤醫院，遼寧 沈陽 100042

放射性肺炎是胸部惡性腫瘤放療后的常見并發癥，普遍認為，早期多種細胞因子相互作用誘導的炎癥反應及后期不可逆的纖維化形成是其主要病理過程［1-2］。“久咳肺虛……或咳血線，口中有濁唾涎沫，脈數而虛，為肺痿之病”“痿者，萎也，如草木之枯萎不榮，為津涸而肺焦也”。中醫多將放射性肺炎歸為“肺痿”范疇。中醫認為放射性肺炎屬本虛標實，其發生發展的病機根本在于火熱之邪耗傷陰血，乃致治節不利，肺葉焦枯，瘀血內阻［3］。治則多從養肺陰、清肺熱、利肺氣立論。北沙參味甘、苦、微寒，歸肺胃經，養陰清肺，“善治一切陰虛火炎”，用于治療肺熱燥咳、久咳肺痿、津傷口渴等癥；桔梗味苦辛，性平，歸肺經，具有利咽排膿、通利肺氣之功，為“肺病之舟楫”［4］。故“北沙參-桔梗”常作為配伍藥對出現于放射性肺炎的治療主方中。但由于中藥成分復雜，其作用機制及作用靶點不明確，不利于進一步深入研究。本研究通過“藥物-疾病-基因-靶點-通路”，從網絡藥理學角度探討中藥在分子層面的作用機制，為中藥治療放射性肺炎提供客觀依據。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分與靶點基因篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）［5］是判斷口服藥物化學成分藥效活性的藥動學參數，是藥物進入血液循環的相對速率，反映藥物吸收、代謝的過程。類藥性（Drug-likeness，DL）［6］是化合物與已知藥物的相似性，DL≥0.18 的化合物被認為有較好的類藥性。本研究選擇中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［7］按OB≥30%、DL≥0.18 的條件篩選“北沙參-桔梗”的潛在有效成分及其對應的靶點蛋白。在人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）（http：//www.genecards.org/）［8］中輸入關鍵詞”Radiation pneumonia”，搜索已知與放射性肺炎關聯的靶基因。對篩選得到的“北沙參-桔梗”靶點和放射性肺炎作用基因進行匹配，獲得靶點基因（交集基因）。

1.2 化合物-靶點網絡圖的描繪將中藥、有效成分、靶點基因、疾病數據導入Cytoscape 軟件描繪有效成分-靶點網絡圖。網絡圖中不同形狀的節點分別顯示中藥、有效成分、疾病及靶點基因，節點之間連線表示中藥-有效成分、有效成分-靶基因、疾病-靶基因的關聯。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網絡(protein-protein interactions，PPl)分析將靶基因導入String數據平臺［9］，物種選擇為“Homo-sapiens”，high confidence=0.4，并隱藏游離靶點，繪制并下載PPI 網絡圖。根據PPI 網絡中靶基因與其他基因的連線數找出PPI 網絡中連接數較多的基因。度值（degree）和介數（betweenness）是判斷網絡節點重要性的主要參數，其數值越大，該節點在網絡中越重要。

1.4 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）在R 語 言 環 境 下 安 裝“clusterprofiler”，對靶點基因進行GO 和KEGG功能富集（P≤0.05，Q≤0.05），繪制主要富集結果的柱狀圖［10］。并根據富集結果探討“北沙參-桔梗”治療放射性肺炎的作用機理，進一步研究“北沙參-桔梗”治療放射性肺炎的生物學功能及KEGG信號通路。

2 結果

2.1 中藥-有效成分-共同靶點基因-疾病的網絡分析共得到OB≥30%、DL≥0.18 的有效成分即“北沙參-桔梗”配伍潛在的靶點基因15個，見表1。

表1 北沙參-桔梗治療放射性肺炎的潛在有效成分

通過檢索GeneCard 數據庫得到與放射性肺炎相關的基因，將中藥的作用靶點基因和放射性肺炎的機制基因進行匹配，共得到124 個共同靶點基因（交集基因）。經Cytoscape 軟件繪制得到“北沙參-桔梗”配伍中15 個化合物與124 個放射性肺炎靶點基因的網絡圖，圖中紅色代表藥物“北沙參-桔梗”，黃色菱形代表疾病（放射性肺炎），黃色圓形代表靶點基因，粉色代表“北沙參-桔梗”藥對潛在有效化學成分。可見，“北沙參-桔梗”配伍中一個有效成分可與多個靶點基因對應，而放射性肺炎的一個靶點亦可與多個化合物成分相關聯。見圖1。

圖1 “北沙參-桔梗”配伍干預放射性肺炎的有效成分-靶點網絡圖

2.2 PPl 網絡將數據導入STRING 數據庫繪制PPI 網絡圖，一個節點表示一個靶點，節點內圖形為基因轉錄的蛋白結構，蛋白結構未知的為空。兩節點之間不同顏色連線表示兩個基因的不同關系。PPI 網絡中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)連接數較多，提示這些靶點是“北沙參-桔梗”干預放射性肺炎的核心機制。其中Akt1 與58 個其他靶點相連接，是PPI 網絡中的核心靶點，其次分別為IL-6（50 基因）、VEGFA（47基因）、MAPK1（45基因）等。見圖2—3。

圖2 “北沙參-桔梗”配伍干預放射性肺炎靶點基因的PPI網絡

圖3 PPI網絡中基因連接數柱狀圖

2.3 富集分析

2.3.1 GO 富集分析 共富集分析得到132 條P≤0.05 的生物過程。adjustP值越小，其可靠性越高，排名靠前的生物過程依次為：細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding）、血紅素結合（heme binding）、泛素蛋白連接酶結合（ubiquitin protein ligase binding）、四吡咯結合（tetrapyrrole binding）、受體調節活性（receptor regulator activity）、蛋白質異二聚活性（protein heterodimerization activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、磷酸酶結合（phosphatase binding）、激酶調節活性（kinase regulator activity）、支架蛋白結合（scaffold protein binding）、生長因子受體結合（growth factor receptor binding）、絲氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、抗氧化活性（antioxidant activity）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、BH 域綁定（BH domain binding）、絲氨酸型內肽酶活性（serinetype endopeptidase activity）、內 肽 酶 活 性（endopeptidase activity）。見圖4。

圖4 “北沙參-桔梗”配伍治療放射性肺炎的GO富集分析

2.3.2 KEGG富集 共富集得到150條P≤0.05的信號通路，將KEGG 富集分析結果按校正P值排序，排名靠前的信號通路為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)、PI3K-Akt、HIF-1、C 型凝集素受體（Ctype lectin receptor，CLR）、松弛素（Relaxin）、Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）、p53 及NF-kappa B等。見圖5。

圖5 “北沙參-桔梗”配伍治療放射性肺炎的KEGG富集分析

3 討論

放射性肺炎發生機制復雜，是多種炎癥細胞及細胞因子共同參與、多種信號分子相互影響、多通路調節的復雜過程［11］。

本研究運用復雜網絡技術，得到“北沙參-桔梗”中15 個化合物和與之相關的124 個放射性肺炎靶點基因，與中醫“同病異治，異病同治”理論相符。其中Akt1 與58 個靶點相連接，是PPI 網絡中的核心靶點，IL-6、VEGFA、MAPK1 和JUN 位于網絡相對中心位置，被認為是放射性肺炎的潛在重要靶點。通過GO 富集分析發現“北沙參-桔梗”藥對主要參與細胞因子活化、抗氧化、免疫調節等生物學過程；通過KEGG富集分析得到TNF、IL-17、PI3KAkt、HIF-1、TLR、p53、NF-kappa B等信號通路。這些靶點及信號通路均是“北沙參-桔梗”治療放射性肺炎發生生物過程的潛在靶點及通路，體現了該藥對多成分、多靶點、多途徑的作用特點。

PI3K/Akt是蛋白激酶耦聯受體介導的經典信號通路，Akt1是一種參與細胞代謝、增殖、上皮化生等多種生物學過程的蛋白，是PI3K/Akt信號通路中的關鍵節點，也是呼吸道上皮細胞炎癥反應的關鍵調節因子，活化的Akt能夠通過活化下游因子，從而激活核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，促進放射性肺炎的發生［12-13］。此外PI3K/Akt信號通路能激活其下游mTOR，調控血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達。TNF-α是一個復合功能的細胞因子，可介導其他炎癥因子表達，與TNFR2結合可激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路，增加炎癥介質浸潤［14-15］，并能刺激成纖維細胞增殖，促進肺纖維化進程。TP53可調控細胞凋亡，抑制NF-κB通路活化，負調控TNF-α等炎癥因子分泌［16］。VEGF 主要作用于血管內皮細胞，增加毛細血管通透性，促進炎性細胞浸潤，同時VEGF具有促進肺間質內分泌性膠原合成的作用，在肺纖維化過程中發揮作用［17-18］。IL-6 能促使漿細胞分泌抗體，刺激C反應蛋白合成，參與早期炎癥反應。研究發現，IL-6 大量表達與PI3K/Akt 通路被激活有關［19-20］。MAPK信號通路是介導細胞反應的重要信號系統，可通過介導SAPK/JNK 通路產生級聯反應，促進炎癥細胞因子生成［21］。

北沙參為傘形科植物，其主要生物活性成分包括香豆素類、黃酮及酚酸類等，本研究中篩選出的香豆素類化合物包括別異歐前胡素（Alloisoimperatorin）、前胡內酯（Ammidin）、異歐前胡素（isoimperatorin）、佛手素（Bergapten）；黃酮及酚酸類包括槲皮素（Bergapten）；甾體類包括豆甾醇（Stigmasterol）［22-23］。多項研究證實北沙參中分離到的別異歐前胡素、異歐前胡素、佛手素及異歐前胡素口服給藥代謝物歐前胡素等香豆素類化合物具有明確的祛痰鎮咳、抗炎平喘及消除自由基、抗氧化、調節并提高免疫功能等作用［24-25］。黃酮類化合物槲皮素可通過下調小鼠肺組織SAPK/JNK表達，阻斷MAPK 通路活化，減少IL-6、TNF-α 等細胞因子釋放，抑制大鼠肺泡細胞凋亡，降低小鼠肺組織炎癥反應程度，對肺損傷有保護作用。同時槲皮素的抗氧化作用可降低纖連蛋白表達，緩解肺組織上皮纖維化［26-27］。有研究發現，北沙參中分離出的豆甾醇具有抗炎活性［28］。2-O-甲基-3-Oβ-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯（Dimethyl-2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A）和2-O-甲基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯（2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A）是桔梗中分離出的桔梗酸A，是桔梗主要的皂苷元，能抑制肺細胞中IL-6、TNF-α等細胞因子表達，下調肺組織中NF-κB蛋白表達［29-30］。桔梗中提取出的木犀草素能通過抑制NF-κB 蛋白表達，抑制IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-β等炎癥細胞因子水平及趨化因子，從而起抗炎等活性作用［31］。

1 項以小鼠為研究對象的藥理實驗表明，北沙參具有鎮咳、祛痰作用，能夠延遲癥狀出現的時間，緩解癥狀嚴重程度［32］。亓潤智等［3、33］通過動物實驗發現放射性肺炎大鼠通過沙參桔梗湯干預后其支氣管上皮細胞變性程度減輕，肺組織上皮細胞及血管內皮細胞損傷緩解，血管內皮通透性降低，炎性細胞浸潤及肺間質滲出減少，同時沙參桔梗湯能降低IL-6 因子表達，療效與劑量濃度呈正相關。楊玉瑩等［34］通過動物實驗發現沙參桔梗湯可降低炎癥因子表達，且療效與劑量相關。這些實驗與本研究結果相符，為“北沙參-桔梗”通過影響IL-6 表達、VEGFA 靶點、抑制PI3K/Akt-Akt1 信號通路治療放射性肺炎提供了組織病理學證據。TLR 是一種跨細胞膜免疫受體蛋白，其中TLR4 能激活NF-κB 信號通路，促進炎癥因子釋放。范瀅［35］研究發現，桔梗提取物可能通過抑制TLR4 信號通路，減輕炎癥反應，減少促炎細胞因子釋放，同時通過抑制NLRP3 信號通路，阻斷IL-6、IL-17等炎癥因子的產生來改善肺纖維化所致炎癥反應。另有多項實驗表明，桔梗皂苷可通過下調IL-6、TNF-α和NF-κB 蛋白表達，抑制小鼠肺組織中炎癥浸潤和自由基生成，減輕氣道重塑［27-28，36］。亦有研究發現，沙參中的異歐前胡素對大鼠成纖維樣細胞的增殖抑制作用，可減少TNF-α炎癥因子表達［37］。王麗芹［38］研究發現以沙參為代表的養陰藥可通過抑制VEGF-mRNA 表達改善大鼠血管內皮通透性，維持血管穩態，減輕大鼠肺纖維化進程。李瑩瑩［39］研究發現經桔梗干預后肺組織的VEGFmRNA、TNF-α表達得到抑制，血管重構減少，通透性降低，肺泡斷裂、融合、結構破壞及肺纖維化程度減輕。姚嵐等［40-41］研究發現北沙參可下調博來霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1及TNF-α蛋白表達，降低肺纖維化大鼠血清中纖連蛋白和層連蛋白含量，抑制成纖維細胞因子活化，維持肺泡和毛細血管基膜結構和功能完整，不僅在放射性肺炎早期減緩損傷發生，也對肺纖維化全過程有抑制作用。

綜上所述，本研究結果與現代藥物、動物實驗結果相符，驗證了“北沙參-桔梗”藥對治療放射性肺炎是多途徑、多環節、多靶點的協同作用，其機制可能與抑制TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達，抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路及MAPK通路有關。