基于網絡藥理學和分子對接技術探討紅花黃色素注射液治療心肌缺血的作用機制?

梁五林，崔 爽，張明倩，祝 娜，張碩峰，3，賈占紅△

1 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488； 2 中央民族大學藥學院，北京 100081；3 西藏藏醫藥大學藏藥系，西藏 拉薩 850030

目前，心血管疾病仍是全球范圍內引起人們死亡和發病的主要原因，而缺血性心臟病與心血管疾病死亡率緊密相關，約占整個心血管疾病死亡的50%［1］。急性心肌梗死是心肌缺血（myocardial ischemia，MI）中較為嚴重的心血管疾病，梗死心肌恢復血流再灌之后進一步加重心肌損傷，誘導心肌細胞凋亡的現象被稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）［2］。IRI 涉及的病理因素包括氧化損傷、能量代謝障礙、Ca2+超載、線粒體損傷、炎癥反應及細胞凋亡等［3-5］。MI及IRI是影響心血管疾病發病率、致死率、傷殘率升高的最主要因素。

紅花黃色素注射液（safflower yellow injection，SYI）是以紅花為基礎研制而成的中藥注射劑，主要成分為羥基紅花黃色素A（HSYA），經國家食品藥品監督管理局批準用于治療心絞痛等心臟病。HSYA 是紅花的主要生物活性成分，是一種具有良好藥用價值的天然色素，在干花中的含量為0.235%～2.074%，也 是 紅 花 的 質 量 標 志 物［6］。HSYA 因其廣泛的藥理活性而受到關注，現代藥理研究表明，HSYA 具有改善心腦血管疾病、緩解肝臟缺血損傷、肺急性損傷、抑制肺纖維化、抗腫瘤、調節代謝和保護內皮細胞等多種生物學作用［4］。本研究運用網絡藥理學和分子對接方法分析HSYA治療MI的靶點和通路，為SYI治療MI的臨床應用提供理論依據。見圖1。

圖1 HSYA化學結構

1 數據庫與軟件

PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Targetnet數據庫（http：//targetnet.scbdd.com/）、CTD數據庫（http：//ctdbase.org/）、UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）、STITCH數據庫（http：//stitch.embl.de/）、ChEMBL數據庫（http：//www.ebi.ac.uk/chembl/）、GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）、OMIM 數據 庫（https：//omim.org）、STRING11.0 數 據 庫（https：//string-db.org）、DAVID 6.8 數 據 庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、RSCB PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）、Venn 圖在線繪制工具Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、在線作圖平臺Sanger Box（http：//sangerbox.com/Tool/）；分 析 軟 件Cytoscape 3.7.2、分子對接軟件包括PyRx、Auto DockTools-1.5.6、Open Babel GUI 及分子對接作圖軟件PyMol。

2 方法

2.1 HSYA 相關靶點的獲取和篩選分別從Targetnet、CTD、STITCH、ChEMBL 等數據庫中獲取HSYA 相關靶點，使用UniProt 數據庫將所得靶點進行校正，最終得HSYA活性成分的基因靶點。

2.2 Ml相關靶點獲取以“Myocardial ischemia”為檢索詞，分別在人類基因數據庫（the human gene database,GeneCards）和在線孟德爾人類遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）獲取MI 相關靶點，將所得靶點匯總并去除重復靶點。

2.3 獲取HSYA與Ml共同靶點利用Venny 2.1在線分析工具對HSYA與MI相關靶點進行對比分析，以Venn圖的形式展現HSYA與MI的交集靶點。

2.4 構建蛋白互作網路（protein-protein interaction，PPl）將HSYA-MI交集靶點導入STRING 11.0在線數據庫，將研究物種設置為“Homosapiens”，Minimum required interaction score 為mediumconfidence＞0.400，隱藏孤立的靶點蛋白，從而得到靶標之間的相互關系，保存為TSV 格式。再將其導入Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI，節點大小和顏色深淺反映degree值大小，degree 值越大，節點越大，顏色越深。

2.5 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）和KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）將HSYA-MI 交集靶點導入DAVID 6.8 數據庫，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homosapiens”，將靶基因名修正為官方名稱（official gene symbol），設定閾值P＜0.05，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，將P值由小到大排序前20位的富集結果導入SangerBox在線作圖平臺進行可視化展示。

2.6 成分-靶標-通路網絡構建篩選出KEGG 通路富集分析中P值由小到大排序前20 位的通路，通過查閱文獻，再篩選出可能與治療MI 有關的通路，找出富集在這些通路上的HSYA治療MI的潛在靶標，將成分、靶標、通路輸入Cytoscape 3.6.2軟件，繪制出成分-靶標-通路網絡圖。

2.7 分子對接從RSCB PDB 數據庫中獲取“成分-靶標-通路”網絡中度值較高的靶點和PPI 網絡中的核心基因的3D 結構PDB 格式文件，運用PyMOL 軟件移除靶蛋白中的水和配體；在PubChem中下載HSYA結構文件，并使用Open Babel GUL軟件轉換為mol2格式文件；使用PyRx軟件對HSYA進行能量最小化處理，使用AutoDock Tools 1.5.6對蛋白分子進行加氫、計算電荷、設置原子類型等操作，并將蛋白和HSYA保存為pbdqt格式文件；在RyRx 中調用AutoDock Vina 算法進行模擬對接；使用PyMOL軟件進行可視化分析。

3 結果

3.1 HSYA 相關靶點從Targetnet 中獲得靶點54 個，從ChEMBL 中獲得靶點25 個，從CTD 中獲得靶點10個，從STITCH中獲得靶點1個，結合Uniprot數據庫確認及轉換，無重復靶點，共得到90 個HSYA相關靶點，見表1。

表1 HSYA潛在靶標信息

3.2 Ml 靶點獲取從GeneCards 中獲得MI 靶點2395 個，從OMIM 中獲得MI 靶點556 個，去除重復靶點364個，最終獲得MI靶點2587個。

3.3 HSYA 與Ml 共 同 靶 點HSYA 與MI 靶 點 融 合后獲得54 個交集靶點，見表2，結果以Venn 圖形式展示，見圖2。

表2 HSYA與Ml交集靶點

圖2 HSYA與MI交集靶點韋恩圖

3.4 PPl 網絡PPI 網絡中包含節點51 個，邊線244 條，根據Degree 大小排序，其中排名前10 的靶標為白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、熱休克蛋白90α家族A 類成員1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、半胱天冬氨酸蛋白酶8（caspase 8，CASP8）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，NOS2）、細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1），它們與HSYA治療MI關系最密切，見圖3及表3。

表3 HSYA潛在靶點拓撲分析值

圖3 HSYA潛在靶標PPI網絡

3.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

3.5.1 GO功能富集 將54個HSYA-MI交集基因導入DAVID數據庫，通過GO功能富集分析得到GO條目392 個（P＜0.05），其中323 個生物過程（biological process，BP）條目，23 個細胞組成（cellular component，cc）條目，46 個分子功能（molecular function，MF）條目，分別選取P值排名前20 位作可視化展示。其中生物過程主要包括：氮化合物代謝過程的正調控、DNA 模板轉錄的正調控，對有機物質、炎性、創傷的反應，細胞活化、增殖、凋亡調節，細胞因子調控及胞內信號轉導等；細胞成分包括：質膜、細胞外基質、細胞外間隙、質膜小葉等；分子功能包括：相同的蛋白結合、脂質結合、啟動子結合、蛋白激酶C 活性、類固醇激素受體活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、鈣通道活性、鈣依賴性蛋白激酶C 活性、蛋白質均二聚化活性等。見圖4。

圖4 HSYA-MI交集基因GO功能富集結果

3.5.2 KEGG通路富集 共得到通路17條（P＜0.05），剔除與MI 關系不大的通路，共獲得10 條通路，涉及癌癥、免疫、炎癥反應、血管內皮功能、凋亡等，分別是腫瘤信號通路、NOD 樣受體信號通路、Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）信號通路、FcεRI 信號通路、病毒性心肌炎、FcγR 介導的吞噬作用、白細胞跨內皮遷移、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、緊密連接及細胞凋亡，見圖5及附圖1—2。

圖5 HSYA-MI交集基因KEGG通路富集結果

附圖1 腫瘤信號通路

附圖2 凋亡信號通路

3.6 成分-靶標-通路網絡圖結合GO和KEGG富集分析結果，篩選出可能具有MI 作用的通路，并與HSYA的潛在靶標一一對應，構建HSYA-靶標-通路網絡。網絡圖中包含39個節點，98條邊線。對該調控網絡進行拓撲分析發現，靶點的平均度值為3.1，介值中心度均值為0.0147；信號通路的平均度值為5.8，介值中心度均值為0.0207。篩選出度值及介值中心度均大于均值的靶點9 個、信號通路2 條，它們在HSYA 治療MI 中發揮著關鍵作用。見圖6及表4。

表4 網絡圖拓撲分析

圖6 HSYA-靶標-通路網絡

4 分子對接結果

結合能小于0 說明配體與受體可以自發結合，且結合能量越低，配體與受體結合的構象越穩定，結合能≤-5.0kcal/mol 說明分子與靶點對接較好。將HSYA 與“成分-靶標-通路”網絡中度值較高的靶點FYN、PRKCB、Akt2、PRKCG、XIAP 與PPI網絡中排名前10 的靶點IL-6、TNF、HSP90AA1、APP、MMP9、CASP8、ESR1、PPARG、NOS2、ICAM1 進行分子對接，并對蛋白靶點的原配體進行分析，得到的數據進行熱圖分析（對接結果只保留每對分子對接的結合能絕對值最高的）。其中HSYA 與靶點IL-6、TNF、APP、MMP9、CASP8、ESR1、PPARG、ICAM1、PRKCB的結合能絕對值均大于原配體結合能的絕對值，且HSYA與各靶點的結合能均≤-5.0 kcal/mol，表明HSYA 與有效靶點具有較好的結合活性。將以上對接結果利用PyMOL 軟件繪圖，可得到HSYA與各靶點形成氫鍵的氨基酸殘基和位置信息，見表5及圖7—8。

表5 HSYA與各靶點形成氫鍵的氨基酸殘基和位置信息

圖7 分子對接數據熱圖分析（kcal/mol）

圖8 分子對接模式

5 討論

MI 是心臟所需血氧、能量失衡而導致的一種病理狀態，冠狀動脈粥樣硬化是引起MI 的常見病因［5-6］。MI損傷的病理基礎較為復雜，涉及多種基因、蛋白、致病因素等共同作用［7-8］。故本研究借助網絡藥理學和分子對接方法對SYI 主要成分、靶點、疾病的生物信息構建網絡，進而探討SYI 治療MI的整體機制。

在PPI 網絡圖中，IL-6、TNF、HSP90AA1、APP、MMP9、CASP8、ESR1、PPARG、NOS2、ICAM1 等為核心靶點。TNF-α與IL-6 為常見的促炎因子，在心肌梗死模型中，TNF-α與IL-6釋放增加，誘導局部炎癥反應［9］。MI 可引起內皮功能障礙，表現為NO 產生受損，而NO 具有舒張血管、抑制炎癥反應和血栓形成的作用［10-11］。MMP9 屬于基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)家族，參與細胞外基質的分解，有研究表明抑制MMPs 表達可減弱與慢性充血、高血壓、心肌梗死等疾病相關的心肌重塑［12］。此外，TNF-α 可通過增強包括MMP9 在內的MMPs 活性減少膠原蛋白合成，調節心臟成纖維細胞中的細胞外基質代謝［13］。故推測HSYA 也可通過抑制TNF-α表達降低MMP9 的活性，從而減輕MI 引起的心臟重塑。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）又稱應激蛋白，當機體處于高溫、氧化應激、感染、缺血等狀態時可被誘導表達，從而保護機體，有保護組織缺血再灌注免受損傷的作用［14］。HSP90AA1 為HSP90α家族A 類1 型,有研究表明，miR-1可負調控HSP90AA1，MI期間抑制miR-1和恢復HSP90AA1 的表達可減輕MI 損傷［15］。APP 為淀粉樣前體蛋白，在MI 模型大鼠中，可溶性APP770（sAPP770）從內皮細胞和血小板中釋放出來，且血漿sAPP 的增加先于心肌酶的釋放，表明sAPP770可作為心肌梗死早期生物標志物的可能性［16］。PPARG 為核受體超家族成員，在動脈粥樣硬化病變中，PPARG 高度表達，其激活可改善心血管細胞的炎癥作用；PPARG還可調節內皮細胞中NOS的表達，從而增加NO 生物利用度［17-18］。半胱天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族為細胞凋亡的主要執行者，而CASP8 是死亡受體介導的凋亡途徑（外源性途徑）中的關鍵啟動子。已有研究表明紅花甲醇提取物可減少由LPS誘導的Caspase-8、BID 和t-BID等死亡受體蛋白表達，減少細胞凋亡［19］。故推測其中發揮抗凋亡的主要活性成分為HSYA，對MI發生時細胞的外源性凋亡途徑有抑制作用。ESR1為雌激素受體1，通過編碼核受體雌激素受體α(estrogen receptorα，ERα)與雌激素17-β-雌二醇相互作用發揮生物學功能。在MI 和MI 再灌注動物模型中，ERα激活可減少梗死面積和心肌細胞凋亡，減輕炎癥反應和氧化應激，誘導血管舒張并增加新血管形成［20］。另外也有研究證實HSYA 可促進雌激素受體陽性細胞T47D 中ERα的表 達［21］。故 推 測 在MI 時，HSYA 可 作 用 于 心 臟ERS1，激活ERα發揮保護作用。通過以上核心靶標分析可知，HSYA 可能通過抑制炎性反應、細胞凋亡、心臟重塑、氧化應激，舒張血管，改善血管內皮功能，促進血管生成等多條途徑治療MI，改善MI損傷。

在KEGG 通路富集中，有10 條通路與HSYA 治療MI 顯著相關，且在“靶點-通路”網絡圖中，由拓撲分析可知腫瘤信號通路和凋亡通路相關度最高。其中腫瘤信號通路富集基因數量最多，包括多條下游信號通路，如Wnt信號通路、mTOR信號通路、PI3/Akt 信號通路、JAK/STAT 信號通路、MAPK信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路、Notch信號通路、p53 信號通路、TGF-β信號通路、鈣信號通路等。HIF-1 是一種調節氧濃度穩態的轉錄因子，在缺氧狀態下，HIF-1α可激活VEGF 信號通路促進血管生成，還可激活NOS2 轉錄，從而促進血管舒張［22］。TGF-β信號通路參與細胞和組織的生長、發育、分化。已有研究證明紅花乙醇提取物可抑制TGF-β1/MMP9 以減輕高血壓模型大鼠的心臟重塑［23］。Smads 為TGF-β重要的信號傳導和調節分子，丹參酸可通過調節TGF-β1/Smad 信號通路抑制心肌纖維化［24］。故推測紅花抗纖維化的作用可能與其主要成分HSYA 作用于TGF-β1/Smad 信號通路，抑制MMP9 表達有關。鈣信號通路可調控動脈粥樣硬化易感性及其炎癥反應，在心血管疾病的發生發展中起重要作用［25］。p53 信號通路部分介導的心肌細胞凋亡在心肌梗死后的病理重塑和心力衰竭的進展中起至關重要作用，抑制p53水平可減少心肌細胞凋亡［26］。另外在凋亡通路中，HSYA 還可能通過作用于TNF、CASP8、XIAP、MAP3K5(ASK1)、AKT、PAPR 等靶點抑制細胞內源性、外源性及內質網應激誘導的凋亡。此外，Wnt信號通路、Notch 信號通路、MAPK 信號通路、PI3/Akt/mTOR、JAK/STAT 信號通路等也參與MI 再灌注損傷，起到保護性或促損傷性作用［27］。病毒性心肌炎的下游信號通路為T 細胞受體信號通路。T細胞受體（TCR）信號通路參與T 細胞激活，誘導細胞內信號級聯反應。缺血后組織中CD4+T 細胞明顯積聚，提示這些免疫細胞可能參與了I/R損傷的發病機制［28］。固有免疫的主要信號通路為NOD 樣受體與TLR 信號通路。NOD 蛋白與下游的受體相互作用磷酸化，進而激活轉錄因子NF-κB，介導炎癥介質表達［29］。TLR 能識別內源性與外源性“危險分子”，啟動炎性免疫應答，TLR4在MI中對誘導炎癥反應并激活下游信號(如NF-κB)起重要作用［30］。可見，SYI可通過多靶點、多通路治療MI。

綜上所訴，本研究通過網絡藥理學和生物信息學技術,初步探討了SYI 治療MI 的作用機制。同時基于分子對接技術初步模擬其可能的分子作用機制，或可為SYI 的后續研究提供新的思路與方法。但是本研究僅從網絡藥理學和分子對接的角度對SYI 治療MI 的分子機制進行了探討，具有一定局限性,還需要進一步的研究驗證。