基于微量元素探討氣血雙補方抗慢性心衰的炮制增效作用?

王 琴，陳子端，陳林偉

南京中醫藥大學泰州附屬醫院，江蘇 泰州 225300

氣血雙補方是著名中醫學家孟景春教授的臨床驗方［1-5］，該方由人參、炙黃芪、酒當歸、酒炒白芍、陳皮、玉竹、酒黃精、制首烏、枸杞子等9味中藥組成，該方具有補益氣血、通陽散結、活血通絡、復脈固脫等功效，主要用于治療慢性心衰（chronic heart failure，CHF）疾病［6］。課題組前期研究發現“氣血雙補方”中的黃芪、當歸、白芍、何首烏、黃精炮制配伍后的復方特征圖譜發生了顯著變化，且臨床研究發現炮制后治療CHF的功效明顯增強，但其炮制增效的作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

微量元素又稱痕量元素，是指小于人體體質量0.01%的元素，人體內共含有微量元素41種，必需微量元素14 種，雖然微量元素在體內總量很少，但其參與人體生命活動的各個環節，主要包括充當酶的輔基、參與核酸蛋白質代謝、抗腫瘤、生長發育、保護心血管、維護神經系統功能、提高機體免疫力等，目前生物無機化學在分子水平方面揭示了微量元素的體內作用機制，而微量元素含量測定為闡明中藥作用機制提供一定參考。

前期研究發現氣血雙補方能降低CHF 模型大鼠體內丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，提高總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量，對損傷心肌具有一定抗氧化保護作用［7］。同時對氣血雙補方中21種微量元素的測定結果表明復方中富含K、Ca、Na、Mg、Fe、Mn、Se、Al等微量元素，且研究表明SOD 依賴Cu、Zn、Fe 發揮生物活性，而Se 濃度與SOD 活性密切相關［8］。因此，本課題提出假說氣血雙補方炮制后是否通過調節體內微量元素增強對損傷心肌的抗氧化保護作用，進而對CHF 產生炮制增效作用。本研究擬通過比較CHF 模型大鼠灌胃生品和炮制品前后血清Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 14 種微量元素含量變化，闡釋氣血雙補方抗CHF的炮制增效作用。

1 材料

1.1 實驗動物健康SD 雄性大鼠20 只，體質量（220±20）g，動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002，購自杭州醫學院。

1.2 儀器WX-4000 型微波消解系統（上海屹堯微波化學技術有限公司）；ISO9001 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；iCAP-6300 型電感耦合等離子發射光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific）。ICP-AES工作條件見表1。

1.3 試劑Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 元素混合標準溶液（1 g/L，100 mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號：19603-1）；硝酸（分析純，500 mL，南京化學試劑有限公司，批號：190722）；過氧化氫（分析純，500 mL，南京化學試劑有限公司，批號：190802）；阿霉素（分析純，上海源葉生物科技公司，批號：20191215）；水為經Millipore Milli-Q 水處理系統處理后的去離子水；氣血雙補生品和炮制品水煎液來自泰州市中醫院藥學部。

1.4 統計學方法采用SPSS 22.0軟件分析數據，計量資料以表示，進行方差分析，采用SIMCA 14.1多元分析軟件進行聚類分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 方法與結果

2.1 SD 大鼠心衰模型的建立及微量元素含量檢測建立CHF 大鼠模型：將SD 大鼠置于正常實驗環境適應性飼養，正常提供食物和水，保證12 h光照周期。將15 mg 阿霉素溶于4 mL 生理鹽水中，配置濃度為3.75 mg/mL，大鼠腹腔注射給藥劑量為2.5 mg/kg，大鼠給藥體積約0.2 mL。兩周內分6 次注射，累積劑量15 mg/kg，即2、4、6、8、10、12天給藥，觀察并確認大鼠心力衰竭癥狀。將CHF SD 模型大鼠20 只隨機分為氣血雙補方生品組和炮制品組，每組10只，分別灌胃0.74 g/kg的復方生品及炮制品水煎液，每天灌胃3 次，灌胃4 周后眼眶取血檢測血清Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 14 種微量元素含量。灌胃后兩組大鼠血清Mg、Ca、Zn、Se 元素含量高于灌胃前（P＜0.05），炮制品組Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Se 元素高于生品組（P＜0.05），說明氣血雙補方炮制前后微量元素含量發生了變化。進一步通過OPLS-DA 分析氣血雙補方炮制前后大鼠血清中差異性微量元素，同時建立VIP 圖，由圖得知氣血雙補方中差異性微量元素VIP＞1的元素主要有Fe、Mg、Ca、Zn、Se、Cu 及Mn 元素，表明大鼠血清中Fe、Mg、Ca、Zn、Se、Cu 及Mn 元素含量炮制后發生了顯著變化。見圖1—2及附表1。

圖1 氣血雙補方炮制品與生品組大鼠血清聚類分析

圖2 VIP圖（OPLS-DA分析）

附表1 兩組大鼠灌胃前后血清中各微量元素含量（n=10） μg/mL

2.2 樣品測定精密量取兩組血清樣品溶液各0.2 mL 于聚四氟乙烯消解罐中，精密加入1 mL HNO3，1 mL 30%H2O2，密閉封裝后，微波消解，140 ℃微波消解2 min，微波功率為500 W；然后升溫至220 ℃，微波功率為1000 W，保持5 min，消解后冷卻，移入5 mL 量瓶中，定容并搖勻，即得供試品溶液，按上述方法制備樣品空白溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 將混合標準溶液（1 g/L）Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 多元素混合標準溶液）連續進樣5次，計算各元素RSD范圍均在1.12%～2.07%之間，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一血清樣品平行測定5次，計算得到Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba 各元素RSD 范圍均在1.23%～2.21%之間，表明該檢測方法穩定可靠。

2.3.3 穩定性試驗 取混合標準溶液（1 g/L）Mg、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、F、Ba多元素混合標準溶液），分別在0、2、4、8、12、24 h進樣6 次，計算各元素RSD 范圍均在0.86%～1.25%之間，表明儀器穩定性良好。

2.3.4 加樣回收試驗 取已知含量的動物血清消解后的供試液，加入適量混合標準溶液，計算14 種元素的平均加樣回收率范圍為93.21%～104.82%，RSD為1.12%～2.64%（n=5）。

3 討論

炮制改變了微量元素的質和量，能使人體必需微量元素溶出量增加，有害元素溶出量降低，并借助輔料中微量元素的作用更好地發揮中藥材療效［9］。并且炮制輔料中含有豐富的有機成分和無機微量元素，對藥物的質量和療效起重要作用［10］。目前關于中藥中微量元素的功效尚不明確，其可能與有機成分并存形成配合物發揮藥效有關。

本研究通過微量元素探討氣血雙補方抗CHF的炮制增效作用，結果發現灌胃炮制品后CHF 動物模型大鼠血清中Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn及Se元素含量高于生品組。Cu、Zn、Se是人體重要的抗氧化酶金屬離子，對心肌具有保護作用；研究表明SOD依賴Ca、Cu、Zn、Mg、Fe、Mn 元素發揮生物活性，而Se、Cu、Zn、Fe、Mn濃度與SOD活性密切相關。

綜上所述，Fe、Ca、Zn、Se、Cu及Mn元素與抗氧化保護作用密切相關，與課題組前期研究發現氣血雙補方能降低CHF 模型大鼠體內MDA 含量，提高SOD 和GSH-Px 含量，對損傷心肌具有一定的抗氧化保護作用相吻合。因此，氣血雙補方炮制后可能通過提高Mg、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn及Se元素含量進一步發揮抗CHF 的炮制增效作用，其更深層次作用機制有待進一步研究。