復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的遺傳性凝血因子X(jué)I缺陷癥家系分析

郭躍麗，雷曉芳，鄭溫潔瑩，孔萬(wàn)仲，奚經(jīng)巧，王明山

凝血因子X(jué)I（FXI）是一種絲氨酸蛋白酶原，主要在肝臟和巨核細(xì)胞中合成[1]，其參與內(nèi)源性凝血途徑，在正常止血過(guò)程中起重要作用[2]。遺傳性FXI 缺陷癥是由FXI 基因（F11）突變導(dǎo)致FXI 水平降低的遺傳性凝血系統(tǒng)異常性疾病，呈常染色體隱形遺傳，主要表現(xiàn)為創(chuàng)傷或手術(shù)后出血增多，自發(fā)性出血情況少見(jiàn)，但FXI 活性（FXI：C）水平高低與出血的嚴(yán)重程度相關(guān)性不高[3-4]。本文通過(guò)對(duì)一個(gè)遺傳性FXI缺陷癥患者家系的臨床表型及基因突變的分析，初步探討其分子致病機(jī)制，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 先證者，女，45 歲，漢族，因“眩暈綜合征”，于2021 年9 月入住溫州市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科治療。凝血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）為85.9s（正常值參考值：29.0 ～43.0 s）、血漿凝血酶原時(shí)間（PT）為13.3 s（正常值參考值：12.8 ～14.5 s）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FXI：C 為2%（正常值參考值：82%～118%）、FXI抗原（FXI：Ag）為4.8%（正常值參考值：90.0%～100%），其他凝血指標(biāo)均無(wú)異常，肝、腎功能正常，平素?zé)o明顯自發(fā)性出血癥狀，但因夏季蚊叮蟲(chóng)咬，皮膚破損后結(jié)痂愈合緩慢。其父母非近親婚配，家系其他成員（共3 代13 人）均無(wú)自發(fā)性出血癥狀。家系遺傳圖譜見(jiàn)圖1。另收集140 例體檢健康者，其中男95 例，女45 例；年齡21 ～48歲；無(wú)肝、腎功能異常，無(wú)出血及血栓史，無(wú)抗凝劑用藥史，女性無(wú)口服避孕藥。本研究經(jīng)溫州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（WZY2022-LW-018-01）。

圖1 遺傳性凝血因子X(jué)I 缺陷癥家系圖

1.2 標(biāo)本采集與處理 采集研究對(duì)象外周靜脈血2.7 ml，用0.109 mol/L 枸櫞酸鈉溶液1 ∶9 抗凝，3 000 r/min 離心15 min 后，取上層乏血小板血漿用于各凝血指標(biāo)的檢測(cè)，下層血細(xì)胞于―40 ℃凍存，用于基因組DNA 的抽提，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及測(cè)序。

1.3 凝血指標(biāo)檢測(cè) PT、APTT、纖維蛋白原（FIB）、FXI：C 等凝血指標(biāo)采用一期凝固法在法國(guó)Stago STA-R全自動(dòng)血凝儀上測(cè)定（配套試劑由法國(guó)STAGO 公司提供）；FXI：Ag 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 引物 根據(jù)FXI基因序列（GenBankAY193837），采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)覆蓋F11 基因所有外顯子區(qū)域及側(cè)翼序列的13 對(duì)引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.5 外周血基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 選用酚-氯仿法提取先證者及家系成員的外周血基因組DNA。PCR 反應(yīng)體系包括2×Taq PCR MasterMix 12.55l，雙蒸水8.0l，DNA 模塊2.05l，10mol/L上下游引物引物各1.0l。用LifePro 熱循環(huán)儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，共30 個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[6]。PCR 產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行電泳和純化，然后使用基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.6 測(cè)序分析 通過(guò)Chromas軟件與美國(guó)NCBI 基因庫(kù)所公布的F11 基因序列（GenBank：AY193837）進(jìn)行比對(duì)，查找基因突變的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后用反向測(cè)序予以證實(shí)，缺失突變用克隆測(cè)序證實(shí)。明確先證者基因突變的位點(diǎn)后，再擴(kuò)增其他家系成員相應(yīng)突變位點(diǎn)區(qū)域并進(jìn)行測(cè)序分析。

1.7 生物信息學(xué)技術(shù)分析

1.7.1 氨基酸序列及保守性分析 應(yīng)用ClustalⅩ-2.1-win 軟件對(duì)人類(lèi)和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的其他5 種同源性物種：黑猩猩（Pantroglodytes）、家犬（Canislupus familiaris）、牛（Bos Taurus）、小家鼠（Musmusculus）、褐家鼠（Rattus norXIegicus）（同源性物種氨基酸序列來(lái)源：https：//www.ncbi.nih.goXI/homologene/104）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析突變氨基酸的保守性。

1.7.2 生物信息學(xué)軟件分析 通過(guò)2 個(gè)在線生物信息學(xué)軟件MutationTaste（rhttps://www.mutationtaster.org/）和PROXIEAN（https://www.jcvi.org/research/provean），預(yù)測(cè)突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。

1.7.3 分子模型構(gòu)建和分析 以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）中提供的三維結(jié)構(gòu)（pdb：5eod）為模型，運(yùn)用Swiss-PdbViewer 4.01 軟件分析p.Gln263stop 對(duì)FXI 蛋白結(jié)構(gòu)的影響，推測(cè)基因突變影響蛋白功能的可能機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 先證者及家系成員表型檢測(cè) 先證者APTT明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)XI：C 和FXI：Ag 較正常對(duì)照顯著減低；先證者母親、二哥、二姐、外甥女、侄子和兒子FXI：C和FXI：Ag均稍減低；家系成員的其他凝血指標(biāo)均無(wú)明顯異常，見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象主要實(shí)驗(yàn)表型及基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 先證者及家系成員基因分析 先證者F5 基因第8 外顯子存在c.841C ＞T（p.Gln263stop）雜合突變及第10 內(nèi)含子3’端剪切位點(diǎn)突變（ IVSJ-4del gttg）。其母親、二哥和侄子存在c. 841C ＞T（p.Gln263stop）雜合突變，其二姐、外甥女和兒子存在IVSJ-4del gttg雜合突變，其余家系成員均為野生型，見(jiàn)表1、圖2。

圖2 遺傳性FXI 缺陷癥患者基因測(cè)序結(jié)果

2.3 保守性分析 ClustalX軟件的保守性分析結(jié)果表明p.Gln263 在同源物種間高度保守，見(jiàn)圖3。

圖3的p.Gln263 在不同物種間的多重序列比對(duì)結(jié)果

2.4 在線生物信息學(xué)軟件分析 MutationTaster 和PROXIEAN在線生物信息學(xué)軟件對(duì)p.Gln263stop 預(yù)測(cè)結(jié)果分別為1.00 分和―5.56 分；MutationTaster對(duì)IVSJ-4del gttg的預(yù)測(cè)結(jié)果為0.982，均顯示為致病的突變，可影響蛋白質(zhì)功能。

2.5 分子模型構(gòu)建和分析 用Swiss-PdbViewer 4.01 軟件對(duì)FⅪ突變前后的蛋白質(zhì)進(jìn)行模型分析，結(jié)果顯示，p.Gln263stop 突變其Gln263 位后的氨基酸及Gln263 都消失，見(jiàn)圖4。

圖4 FXI 蛋白質(zhì)模型圖

3 討論

遺傳性FXI 缺陷癥由Rosenthal 等[7]于1953 年首次報(bào)道，為常染色體隱形遺傳性疾病，主要與合成FXI蛋白的基因發(fā)生突變有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)了約236種與FXI 缺陷癥有關(guān)的基因突變，包括錯(cuò)義/無(wú)義突變、剪切位點(diǎn)突變、調(diào)控區(qū)突變、小片段缺失突變、小片段插入缺失突變、大片段缺失突變等[8]。

本例先證者平素?zé)o明顯自發(fā)性出血癥狀，因夏季蚊叮蟲(chóng)咬，皮膚破損后結(jié)痂愈合緩慢，實(shí)驗(yàn)室檢查APTT 明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)XI：C 明顯減低，F(xiàn)Ⅷ：C、FⅨ：C、FXⅡ：C 無(wú)明顯異常，初步診斷為FXI 缺陷癥。通過(guò)先證者及家系成員基因分析發(fā)現(xiàn)：先證者F11 基因攜帶p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 復(fù)合雜合突變；其母親、二哥和侄子攜帶p.Gln263stop 雜合突變，其二姐、外甥女和兒子攜帶IVSJ-4del gttg雜合突變；p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 復(fù)合雜合突變（先證者）引起FXI：C 明顯下降，而單獨(dú)存在p.Gln263stop或IVSJ-4del gttg 單雜合突變引起其FXI：C 水平稍低于正常對(duì)照水平。從本家系分析推測(cè)，先證者F11基因p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 復(fù)合雜合突變分別遺傳自其母親和父親，該復(fù)合雜合突變與其FXI：C 水平明顯下降有關(guān)。

檢索F11基因庫(kù)發(fā)現(xiàn)，p.Gln263stop 和IVSJ-4del gttg 均已有報(bào)導(dǎo)[9-11]。筆者通過(guò)對(duì)F11 的p.Gln263 不同物種間的多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其具有高度保守性；其c.841C ＞T 雜合無(wú)義突變，使編碼263 位的谷氨酰胺提前出現(xiàn)終止密碼子（CAA-TAA），多肽鏈截短使AP3 缺失部分序列，整個(gè)AP4 區(qū)域和輕鏈區(qū)也全部缺失，結(jié)構(gòu)域的不完整和截短蛋白的不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致FXI：C 水平的下降。多個(gè)研究亦顯示，p.Gln263stop 可能為中國(guó)人群中遺傳性FXI 缺陷癥的突變熱點(diǎn)[12-13]。謝爽等[9]發(fā)現(xiàn)，IVSJ-4del gttg 突變可能導(dǎo)致內(nèi)含子10 不能被正常剪切，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA因含有內(nèi)含子10 的序列而出現(xiàn)終止密碼；或者轉(zhuǎn)錄過(guò)程中利用隱匿剪切位點(diǎn)剪切，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止；或者外顯子11 在剪切過(guò)程中被切除，外顯子10 和外顯子12 直接連接，所翻譯的蛋白質(zhì)高度不穩(wěn)定而被迅速降解，從而影響FXI的合成和分泌。翁妙珊等[12]對(duì)7 例FXI 缺陷癥患者的研究發(fā)現(xiàn)，其中4 例復(fù)合雜合突變或純合突變患者均存在臨床出血癥狀。因此，筆者推斷本例先證者皮膚破損、結(jié)痂難以愈合的癥狀可能與p.Gln263stop 協(xié)同IVSJ-4del gttg 復(fù)合雜合突變有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)XI 缺陷癥家系FXI 水平降低可能與p. Gln263stop 雜合無(wú)義突變和IVSJ-4del gttg 剪切位點(diǎn)突變有關(guān)，其具體的致病機(jī)制有待體外表達(dá)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 郭躍麗、鄭溫潔瑩、雷曉芳：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫(xiě)；孔萬(wàn)仲、奚經(jīng)巧：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；王明山：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持