濱州地區凡納濱對蝦苗種蝦肝腸胞蟲病的調查和分析

崔瑋琪 馮曉 宋瑞強 楊勛 楊雙 蘇兆軍

摘 要：為全面、系統地了解濱州市地區凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）苗種攜帶蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）及爆發情況，對濱州地區37家凡納濱對蝦養殖池塘隨機采集對蝦苗種樣本，根據SC/T 7232-2020 《蝦肝腸胞蟲病診斷規程》采用套式PCR法進行對蝦苗種蝦肝腸胞蟲的檢測，檢測結果表明濱州地區蝦肝腸胞蟲陽性檢測率為4.84%，同時監測蝦肝腸胞蟲病發病池和未發病池的水質，發現發病池的水體中pH值、COD等指標并沒有顯著差異，說明蝦肝腸胞蟲病爆發并不是由于養殖池水質導致的。

關鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）；PCR；檢出率

近年來由于對蝦疫病的頻繁爆發，使得對蝦養殖業受到了較大的沖擊。其中有一種常見的疾病在泰國、印度、越南和中國等國家中流行，可造成對蝦苗種生長極其緩慢或停止［1］，其病原微生物為蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。

EHP的流行率較高，已經成為威脅我國養殖業的一個嚴重病原。我國于2013年在浙江臺州養殖的凡納濱對蝦的肝胰腺中首次檢出EHP，此后在我國沿海地區陸續發現大量EHP感染病例。2015年遼寧營口的對蝦EHP檢出率為34.6%［2］；粵西地區養殖對蝦EHP檢出率為41.38%［3］；浙江舟山養殖對蝦EHP檢出率為85.19%［4］，檢出率逐年上升。本文就濱州地區EHP的發病率進行調查分析，以期為建立有效防控技術方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

調查區域包括濱州市沾化區、無棣縣、博興縣凡納濱對蝦工廠化養殖池，隨機抽取37家苗種養殖場進行抽檢（選取苗種日期相近的養殖場）。此次調查從3月開始到7月結束，每七天為一個周期進行取樣檢測，共計得到樣品195份。

1.2 樣品EHP檢測

1.2.1 樣品前處理 取凡納濱對蝦蝦苗全蝦在已滅菌的研缽中研磨，將研磨后的組織放在無菌的離心管中，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 總DNA的提取 取研磨好的樣品約20 mg左右，采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 DNA提取試劑盒進行對蝦樣品總DNA的提取，提取后采用-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 檢測 根據SC/T 7232-2020《蝦肝腸胞蟲病診斷規程》采用套式PCR方法進行擴增，套式PCR擴增體系所需引物序列見表1，PCR擴增反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，30個循環，最后4 ℃保溫。產物經1%瓊脂凝膠電泳檢測后， 送至生工生物工程（濟南） 股份有限公司測序，測序結果與NCBI數據庫進行進一步的基因序列對比，進一步驗證結果的準確性。

2 結果與分析

將兩輪陽性PCR擴增產物進行測序，并將測序結果與NCBI數據庫中EHP的致病基因序列進行比對，結果顯示PCR擴增出的陽性片段與NCBI數據庫中的EHP致病基因的序列相似度為98%。部分對蝦樣品的電泳圖見圖1和圖2。

3 討論

3.1 濱州地區EHP感染情況

本研究對2022年3—7月期間濱州地區的凡納濱對蝦苗種養蝦池EHP的感染情況進行了調查與分析，結果表明，EHP的發病率在4.84%，主要集中在4—5月。通過對發病池和未發病池的水質進行監測發現，其pH值、COD等指標并沒有顯著差異。

3.2 病因分析

蝦肝腸胞蟲病（Enterocytozoon hepatopenaei disease）也稱作肝胰腺微孢子蟲病（Hepatopancreatic microsporidiosis， HPM），最早是在馬來西亞養殖斑節對蝦的肝胰腺中發現的［5-6］，2004年研究人員發現泰國養殖斑節對蝦體中也存在微孢子感染，Tourtip等 （2009）將這類感染對蝦肝胰腺的微孢子蟲正式命名蝦肝腸胞蟲，此后在越南、印度、中國、委內瑞拉等國家幾乎同時檢測出EHP，目前EHP已經成為危害我國水產養殖業的主要病原之一。

蝦肝腸胞蟲在分類上屬微孢子綱（Microsporea），腸胞蟲科 （Enterocytozoonidae） ，腸胞蟲屬（Enterocytozoon）［7］，是一種可感染多種真核生物的專型細胞內寄生真菌。成熟的蝦肝腸胞蟲的孢子呈橢圓形，具有極絲、1個細胞核和1 個后位空泡，由幾丁質構成的孢包裹，大小為（1.1±0.2）μm×（0.7±0.1）μm［8］。患病對蝦肝胰腺和腸道顏色較深，嚴重者肝胰腺萎縮，生長緩慢，個體明顯偏小，感染群體生長差異明顯增大。正常養殖條件下，攝食正常，腸胃充滿食物，不出現大量、急性死亡。體長相同時，發病群里的平均體重約為EHP陰性的70%。

濱州地區EHP發病率為4.84%，相對較低，造成原因有兩個方面，一是EHP的傳播有兩種形式：一種是垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代；另一種是水平傳播，即攝食寄生EHP的鮮活餌料、病蝦、死蝦或環境中的孢子體而感染［9-10］。通過對發病池和未發病池水質進行監測發現兩者差異不顯著，可能是由于采集的樣品為蝦苗，尚未攝食鮮活餌料，因此未發生水平傳播，沒有造成大范圍的傳染。二是由于2020年起，為從源頭嚴格控制重大水生疫病的傳播，山東省開始實行水產苗種產地檢疫工作，加大對出廠苗種的管控力度，提高了水產苗種質量，降低了疫病發生率。

3.3 防控措施

苗種作為最重要的投入品，處于養殖生產中的首要環節，實施苗種檢疫可以從源頭切斷疫病的傳播途徑，因此養殖企業購買苗種時應購買具有資質的檢測機構檢測合格的苗種。

水質是對蝦養殖過程中第二個重要環節。水質管理的好壞，直接決定著對蝦養殖的成敗，因此養殖池中的水要進行徹底消毒后方可使用，且要時時監測養殖水的指標。

出現對蝦生長緩慢現象的養殖池要進行徹底的清塘和消毒，防止病毒繼續傳播。

參考文獻：

[1]

BIJU N，SATHIYARAJ G，RAJ M，et al.High prevalence of Enterocytozoon hepatopenaei in shrimps Penaeus monodon and Litopenaeus vannamei sampled from slow growth ponds in India[J].Diseases of aquatic organisms，2016，120（3）：22-30.

[2] 王博雅，王力，劉美如，等.凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區的流行情況分析[J].大連海洋大學學報，2017，32（2）：150-154.

[3] 陳祿芝.粵西地區凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調查[J].漁業研究.2016.38（4）：273-280.

[4] 施慧，許文軍，謝建軍，等.舟山地區大棚凡納濱對蝦生長緩慢病因的調查分析[J].中國水產科學，2017，24（2）：387-394.

[5] ANDERSON I G，SHARIFF M，NASH G.A hepatopancreatic microsporidian in pond-reared tiger shrimp，Penaeus monodon from Malaysia[J].Journal of Invertebrate Pathology，1989， 53（2）：278-280.

[6] ARANGUREN L F， HAN J E， TANG K F J.Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease （AHPND） and septic hepatopancreatic necrosis （SHPN） in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei[J].Aquaculture，2017，471：37-42.

[7] 胡吉卉，李正民，段健誠，等.蝦類肝腸胞蟲流行病學研究進展[J].水產養殖，2020，41（11）：1-4，10.

[8] 王維娜，王安利，陳麗，等.斑節對蝦體內微孢子蟲的超微結構[J].動物學報，2001（47）：78-81.

[9] 許杰，鄧威，李軍，薛淑霞，等.蝦肝腸胞蟲（EHP）流行病學與檢測技術研究進展[J].中國動物檢疫，2018，35（2）：64-68.

[10] 駱云慧，石堅，方磊，等.蝦肝腸胞蟲TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學，2016，46（7）：847-852.

（收稿日期：2023-02-15；修回日期：2023-02-24）