環(huán)境DNA揭示東江流域水生昆蟲生物多樣性變化及影響因素

尹雪 秦珊 王宗陽 殷旭旺 張遠

摘 要：以東江流域為例，通過環(huán)境DNA技術探究了水生昆蟲群落的空間分布規(guī)律及其環(huán)境影響因子。結果顯示：1）水生昆蟲物種豐富度由高到低順序為：雙翅目（7科）＞蜉蝣目（6科）＞毛翅目（2科）=蜻蜓目（2科）=鞘翅目（2科）＞鱗翅目（1科）。雙翅目（84.99%）和蜉蝣目（14.89%）共占總reads數(shù)99.88%，搖蚊科（69.20%）、四節(jié)蜉科（14.36%）及蚊科（14.26%）三個科合計占總reads數(shù)97.82%。2）物種豐富度指數(shù)、香農維納指數(shù)、辛普森指數(shù)與功能豐富度指數(shù)（FRic）、功能離散度指數(shù)（FDiv）均與距河口距離呈正相關關系。功能均勻度指數(shù)與距河口距離呈負相關關系。3）海拔是影響物種豐富度最重要的環(huán)境因子（P＜0.01），COD是影響物種豐富度的重要環(huán)境因子（P＜0.05）。海拔、DO、COD是影響功能豐富度的重要環(huán)境因子（P＜0.05）。

關鍵詞：東江流域；水生昆蟲；物種多樣性；功能多樣性；環(huán)境DNA

中圖分類號：S941.419

水生昆蟲是河流生物多樣性中重要生物類群［1］。水生昆蟲對環(huán)境變化和人類干擾敏感，對干擾的反應范圍廣，我們可以通過其被干擾后的影響進行空間分析［2］；水生昆蟲有較長的生活周期，能綜合反映較長時間段內的水體質量狀況［3］。水生昆蟲的生態(tài)學性狀（如攝食方式、大小、生存位置、棲息地改造、移動性等）在很大程度上影響其生態(tài)功能貢獻［4-5］。盛天進等［6］研究認為物種多樣性有助于確定未來河流群落恢復差距。物種多樣性雖被廣泛使用，但其僅考慮物種的豐度和多度，忽視了物種的功能性狀［7］，近年來功能多樣性概念得到重視，其是通過量化一個群落內的性狀變異或多變量性狀差異來理解群落和生態(tài)系統(tǒng)［8］。

環(huán)境DNA（Environmental DNA， eDNA）是指從土壤、水、冰川或沉積物等環(huán)境樣品中提取的DNA，可揭示過去和現(xiàn)今的生物多樣性信息［9］。與傳統(tǒng)采樣方法相比，該方法成本更低，樣本采集受氣候條件影響較小。近年使用環(huán)境DNA技術進行生物監(jiān)測逐漸興起。環(huán)境DNA最早應用于法國池塘中檢測到北美牛蛙［10］。隨著該方法研究的爆發(fā)式增長，不同樣本類型的環(huán)境DNA在物種豐富度估算方面十分成功［9］。樣本類型從淡水［11-13］、海洋［14-15］、陸地［16-18］到空氣［19-20］。環(huán)境DNA技術的出現(xiàn)為水生生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的研究開辟了一條新道路，具有極大的應用潛能。

目前，使用環(huán)境DNA技術對我國亞熱帶河流水生昆蟲物種多樣性及功能多樣性變化研究仍處于空白。本研究選取我國典型亞熱帶河流東江水系為研究區(qū)域，旨在探究東江流域水生昆蟲的群落多樣性三個關鍵問題：一是東江流域水生昆蟲的群落組成特征；二是流域內水生昆蟲的空間格局分布規(guī)律；三是影響水生昆蟲群落結構差異以及物種多樣性的因素。

1 材料與方法

1.1 采樣點的選擇和樣品的采集

東江為珠江流域三大水系之一，介于東經(jīng)114°47′36″至115°52′36″，北緯24°20′30″至25°12′18″之間，位于珠江三角洲的東北端，地勢東北高，西南低。干流全長 562 km，發(fā)源于江西省尋烏縣椏髻缽山，流入廣東省境內經(jīng)龍川、東源、源城、紫金、惠陽、惠城、博羅至東莞市，最后注入獅子洋，經(jīng)虎門出海，河道平均坡降0.388‰，流域面積35 340 km2。屬亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)［21］，河流年均徑流量257億m3。本研究采樣于2021年10月，共計51個樣點，其中干流23點位、支流浰江6點位、石馬河6點位、西枝江16點位，監(jiān)測點位（見封三圖1）示。

環(huán)境DNA樣品使用Rocker過濾裝置、0.45 μm混合纖維素脂濾膜過濾采集的水樣，每500 mL過濾一個濾膜，使用滅菌鑷子從邊緣夾起濾膜，將其放置于5 mL無菌離心管內，-20 ℃干冰保存，帶回實驗室后保存于-20 ℃冰箱，直到提取DNA。過濾用的杯子在每次使用后均用純凈水沖洗2～3遍。

現(xiàn)場使用多參數(shù)水質監(jiān)測儀（YSI Incorporated，Yellow Springs，USA）進行水質原位測定，包括pH、溶解氧（DO，mg/L）、電導率（EC，μS/cm）、水溫（Temp，℃）、溶解性總固體（TDS，mg/L）、氧化還原電位（ORP，mV）、鹽度（SAL，PSU）、葉綠素a（CHLA，μg/L）。另采集1 L水樣送到實驗室，按照中國國家標準測定方法測定：氨氮（NH+4-N，mg/L）、總氮（TN，mg/L）、總磷（TP，mg/L）、磷酸鹽（PHOS，mg/L）、高錳酸鹽指數(shù)（COD，mg/L）、硝酸鹽（NO-3-N，mg/L）、亞硝酸鹽（NO-2-N，mg/L）等指標。現(xiàn)場還用手持GPS進行經(jīng)緯度定位和海拔高度測量。

1.2 DNA提取和PCR擴增

DNA提取步驟按照ZymoBIOMICSTM DNA Miniprep Kit說明書進行。正向引物fwhF2（5'-GGDACWGGWTGAACWGTWTAYCCHCC-3'），反向引物EPTDr2n（5'-AAACAAATARDGGTATTCGDTY-3'），采用上述eDNA模板進行水生昆蟲的PCR擴增。引物fwhF2-EPTDr2n擴增長度在150～315 bp之間。25 μL反應體系包括：4 μL模板DNA、正反向引物各1 μL、2 μL dNTPs、2.5 μL Buffer、0.125 μL Taq HS以及14.375 μL DEPC。PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s; 35個循環(huán)包括： 95 ℃變性5 s， 54 ℃退火30 s， 72 ℃延伸10 s; 72 ℃最后延伸5 min。51個采樣點各設置一個陰性對照，PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂凝膠電泳檢測。COI區(qū)域所有隱性對照均無目的條帶，表明無外源污染。

1.3 高通量測序和數(shù)據(jù)處理

將等量PCR產(chǎn)物匯集在一起，使用Illumina PE150平臺進行高通量測序。對測序得到的序列信息進行拼接得到原始數(shù)據(jù)，經(jīng)質控和去嵌合體得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。對有效數(shù)據(jù)進行去冗余、去單一序列和97%相似度的OTU（Operational Taxonomics Table，可操作分類單元）聚類分析，根據(jù)OTU聚類結果，對每個OTU的代表序列數(shù)據(jù)庫比對作物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況，即OTU Distribution Table（以下簡稱 OTU Table）。

1.4 生物信息學分析

采用圖圖云平臺（www.cloudtutu.com）的alpha多樣性指數(shù)工具包計算α多樣性指數(shù)，散點圖工具包中的spearman方法完成散點圖的制作。利用參考文獻[22-23]進行功能性狀的等級劃分。本研究選擇水生昆蟲的游泳能力、吸附能力、形狀、生活型、營養(yǎng)習性、最大體長以及生活史等7個功能性狀的27個等級性狀納入分析（見表1）。大多數(shù)性狀信息基于百度百科（https：//baike.baidu.com）及書籍［24-29］進行搜集。采用Rstudio軟件FD功能包的dbFD函數(shù)計算功能多樣性指數(shù)。使用SPSS 27.0.1對環(huán)境變量進行線性回歸分析。保留ASL、pH、DO、ORP、SAL、CHLA、PHOS、COD、NO-2N等9個環(huán)境變量構建簡約模型解釋群落結構變化。采用凌波微課（http：//www.cloud.biomicroclass.com）DCA分析工具包先做DCA分析。本研究DCA分析后第一軸值為1.39，故選擇RDA分析。RDA分析前，為避免環(huán)境因子間的共線性，對環(huán)境因子數(shù)據(jù)進行了log（x+1）轉換。使用凌波微課RDA分析工具包對環(huán)境因子進行可視化。Mantel test分析對α多樣性指數(shù)與功能多樣性指數(shù)的相關關系進行檢驗并在圖圖云平臺進行可視化。物種多樣性、功能多樣性與環(huán)境變量之間關系的網(wǎng)絡圖與顯著影響的環(huán)境變量相關性分析圖疊加熱圖的Mantel Test分析以及偏曼特爾檢驗均使用圖圖云平臺計算制作。采樣點圖用Arcgis10.7軟件制作。

2 結果

2.1 東江水生昆蟲物種組成

東江水生昆蟲共獲得57 142 012條reads，經(jīng)過生物信息學過濾，保留了6 435 709個reads。在所有采樣點和重復中，共獲得昆蟲綱6目20科89屬166種。其中，雙翅目和蜉蝣目為兩大優(yōu)勢類群，共占總reads數(shù)99.88%，優(yōu)勢十分明顯。搖蚊科（69.20%）、四節(jié)蜉科（14.36%）及蚊科（14.26%）三個科合計占總reads數(shù)97.82%，東江流域水生昆蟲分類情況見表2。

2.2 物種多樣性與功能多樣性空間分布

對物種多樣性空間格局統(tǒng)計分布（見封三圖2-a、2-b、2-c），結果表明：物種豐富度指數(shù)范圍在3～15之間；香農指數(shù)范圍在0.03～1.75之間；辛普森指數(shù)范圍在0.01～0.79之間。對東江流域水生昆蟲物種多樣性分析后發(fā)現(xiàn)，物種豐富度、香農指數(shù)、辛普森指數(shù)均呈現(xiàn)干流上游及支流高，干流中下游低的分布現(xiàn)象。

對功能多樣性空間格局統(tǒng)計分布，見圖2-d、2-e、2-f，結果表明：功能豐富度指數(shù)范圍在0.63～12.06之間；功能均勻度指數(shù)范圍為0～0.88；功能離散度指數(shù)范圍在0.52～0.99之間。對東江流域水生昆蟲功能多樣性分析后發(fā)現(xiàn)，功能豐富度指數(shù)在干流上游及支流分布明顯高于干流中下游，見圖2-d；功能均勻度指數(shù)在干流上下游及支流分布較為均勻，見圖2-e；功能離散度指數(shù)較高，且均勻分布在各個點位，見圖2-f。

環(huán)境DNA還揭示了東江流域水生昆蟲物種多樣性及功能多樣性隨距河口距離變化的趨勢。結果顯示，物種豐富度指數(shù)（見圖3-a）、Shannon指數(shù)（見圖3-b）、Simpson指數(shù)（見圖3-c）與FRic指數(shù)（見圖3-d）、FDiv指數(shù)（見圖3-f）均與距河口距離呈正相關關系。FEve指數(shù)（見圖3-e）與距河口距離呈負相關關系。

2.3 水生昆蟲生物多樣性變化確定因素

通過方差膨脹因子去除共線性較高（VIF值＞10）的環(huán)境因子EC、Temp、TDS、NH+4-N、TN、TP、NO-3-N等引起東江流域水生昆蟲群落結構差異的影響因素，保留ASL、pH、DO、ORP、SAL、CHLA、PHOS、COD、NO-2-N等9個環(huán)境變量。冗余分析（RDA分析）結果顯示，東江流域水生昆蟲群落結構同時受ASL、COD（P＜0.01）和PHOS（P＜0.05），見圖4。不同環(huán)境因子對各軸的貢獻也不同。NO-2-N、COD、pH、CHLA、ASL與軸1相關，PHOS、SAL、DO、ORP與軸2相關。其中，NO-2-N、COD與軸1正相關，PHOS、SAL與軸2正相關。第一軸和第二軸分別可以解釋采樣點與環(huán)境關系的78.76%和9.94%。

跟著圖5，沿著軸2正方向，PHOS、SAL逐漸增大、DO、ORP逐漸減小，蛾蚋科、搖蚊科、蚊科、螟蛾科、四節(jié)蜉科、水蠅科、龍虱科、蜉蝣科逐漸增多，其它水生昆蟲逐漸減少。

使用偏曼特爾分析可以排除環(huán)境因子之間自相關的干擾，如圖6（見封三）及表3所示，ASL是影響物種豐富度最重要的環(huán)境因子（P＜0.01），COD是影響物種豐富度的重要環(huán)境因子（P＜0.05）。 ASL、DO、COD是影響功能豐富度的重要環(huán)境因子（P＜0.05）。

3 討論

河流作為一個完整的生態(tài)系統(tǒng)，具有一定程度凈化污染物的能力［30］。物種豐富度指數(shù)的分布情況可以說明東江干流中下游及西枝江下游采樣點位于海拔較低處，且受生活污染的排放及土地利用格局變化的影響較大。東江源海拔較高，河岸為山林，人口較少，主要種植臍橙和蜜橘，屬農業(yè)區(qū)，河流受干擾相對較少，水質較好。東江干流中游城鎮(zhèn)人口多，受生活污染物的排放及有少量航運、漁業(yè)活動的影響較大，河岸遍布竹林；東江下游多為平地，氣候條件適宜，更適合人類生存與城鎮(zhèn)建設，因此下游城鎮(zhèn)化水平比上、中游明顯提高，工業(yè)化和城市化進程加速了經(jīng)濟發(fā)展的同時也引起了一系列環(huán)境問題，大量工廠和貨運碼頭，航運頻繁［31-32］。東江下游西枝江是東江的第二大一級支流，發(fā)源于惠州市惠東縣與河源市紫金縣交界處，流經(jīng)惠東縣、惠陽區(qū)、惠城區(qū)后匯入東江［33］。西枝江上游區(qū)域有自然保護區(qū)白盆珠水庫，居民少，污染排放少，水質情況較好；而中游和下游區(qū)域人口相對集中，工業(yè)較為發(fā)達，點源污染占到污染源負荷的85%以上，西枝江下游部分水域處于東江干流劍潭庫區(qū)內，水生態(tài)狀況直接影響東江干流水質［34］。石馬河為東江的一級支流，源于深圳市寶安區(qū)龍華鎮(zhèn)大腦殼山，上接觀瀾河，寶安區(qū)工業(yè)企業(yè)分布密集，工業(yè)廢水排放較多，劇烈的人類活動使石馬河受污染嚴重［35］。浰江是東江流域一級支流，張輝等［36］研究表明浰江水體優(yōu)勢種較多，優(yōu)勢種的多樣化也反映了浰江水體生境的多樣性，整體而言，浰江受人類活動干擾小，河網(wǎng)結構相對簡單，對生態(tài)變化抗性較弱。

各采樣點間海拔的不同，會形成不同的水溫和溶解氧含量，在源頭溪流中，河岸帶凋落物是溪流生態(tài)系統(tǒng)主要的能量來源，因此大型底棲動物以撕食者和集食者為主［37］。一些水生昆蟲的有翼成蟲常年存在，這些擴散能力強的水生昆蟲對環(huán)境變化比較敏感，善于逃離不良環(huán)境，尋找新的棲息地的能力強。按河流連續(xù)理論，連續(xù)變化的河流其生物群落多樣性常常會逐步降低［38］。Paller等［39］研究認為水生昆蟲群落多樣性會隨著海拔的升高而逐步降低。但東江源頭水體底質為卵石和礫石為主，人為干擾較少，可能促進了水生昆蟲生物多樣性的上升。

受環(huán)境因子的作用、篩選，生物性狀是物種適應環(huán)境并長期進化的結果，在特定的棲息地環(huán)境條件下，會存在特定的生物性狀［40］。近年來，對于生物多樣性的調查由物種多樣性擴展至功能多樣性［23］。功能多樣性考慮了群落組成物種的功能性狀對生態(tài)過程的需求和響應［41］。目前，對于東江流域水生昆蟲物種多樣性和功能多樣性的研究還很少。功能豐富度（FRic）、功能均勻度（FEve）、功能離散度（FDis）分別代表功能多樣性的不同側面，相互獨立。FRic取決于物種所占據(jù)的功能生態(tài)位空間的大小，也取決于功能特征值的范圍［42］。FEve指數(shù)衡量物種性狀在已占據(jù)生態(tài)位空間的分布均勻程度， 值越高表明物種對環(huán)境資源的利用越充分［43］。FDis指數(shù)高說明生態(tài)位離散程度高，資源競爭程度低。物種多樣性和功能多樣性的空間分布特征存在一定的相關性（見圖2）。FRic指數(shù)的空間分布格局與物種豐富度反映的格局一致，均呈現(xiàn)東江干流上游、支流高，中下游低的格局，可能是FRic十分依賴物種數(shù)目的原因［44］。主要因為物種越多，功能性狀異質性越強，群落所占據(jù)的生態(tài)位空間一般也會越大，這和蔣萬祥等［45］的研究一致。

距河口的距離，顯示著沿河流的河源至河口的縱向梯度變化，水生昆蟲沿著東江流域呈現(xiàn)縱向梯度的空間變化，在人類活動干擾和經(jīng)濟發(fā)展影響下，東江流域從上游至下游水體復雜性上升，水生昆蟲生物多樣性降低，物種多樣性指數(shù)與功能多樣性指數(shù)均隨距河口距離的增加而增加。FEve指數(shù)越高表明物種對環(huán)境資源的利用越充分、性狀分布越規(guī)律，可以說明東江源處的水生昆蟲對環(huán)境資源的利用隨著距河口距離越近，對環(huán)境資源的利用越充分、性狀分布越規(guī)律。

由于地理位置、人為影響等因素的不同，以及河流各區(qū)段之間的相互關聯(lián)，水體中的養(yǎng)分會表現(xiàn)出不同的變化特征［46］，反映著該河流的主要污染因子及影響因素和可能來源，有助于評價水體被污染和自凈的狀況［47］。李飛龍等［48］研究表明不同水生態(tài)區(qū)間各類環(huán)境要素的差異性是造成EPT群落時空分布的內在原因。

排序分析反映了環(huán)境因子對物種組成的影響。線段越長代表該環(huán)境因子對物種分布的影響越大，環(huán)境因子與采樣點之間的夾角能反映出環(huán)境因子與采樣點的相關性。pH值、CHLA與ASL對大多數(shù)物種的影響呈正相關關系。

黃志偉［49］等研究發(fā)現(xiàn)與礦產(chǎn)開采及農業(yè)耕作活動較為頻繁有關，東江流域中上游地區(qū)各類重金屬含量相對較高。賈銀濤等［50］研究發(fā)現(xiàn)采礦會使河流內懸浮物增多，生物棲息地多樣性下降。因此，其他環(huán)境因子，如水體重金屬含量也需作為可能影響水生昆蟲群落變化的因素進行考量。另外，雖然我們的目標類群是水生昆蟲物種，但我們也檢測到了其它類群，如藻類。說明引物fwhF2-EPTDr2n不僅適用于昆蟲，還適用于包括藻類在內的其他生物。COI區(qū)域的其它引物也出現(xiàn)了這樣的現(xiàn)象［11］。缺乏針對水生昆蟲的高特異性引物是一個重要問題。

4 結論

水生昆蟲物種豐富度由高到低順序為：雙翅目（7科）＞蜉蝣目（6科）＞毛翅目（2科）=蜻蜓目（2科）=鞘翅目（2科）＞鱗翅目（1科）。雙翅目（84.99%）和蜉蝣目（14.89%）共占總reads數(shù)99.88%，優(yōu)勢十分明顯。搖蚊科（69.20%）、四節(jié)蜉科（14.36%）及蚊科（14.26%）三個科合計占總reads數(shù)97.82%。

物種豐富度、香農指數(shù)、辛普森指數(shù)均呈現(xiàn)干流上游及支流高，干流中下游低的分布現(xiàn)象；功能豐富度指數(shù)在干流上游及支流分布明顯高于干流中下游，功能均勻度指數(shù)在干流上下游及支流分布較為均勻，功能離散度指數(shù)較高，且均勻分布在各個點位。環(huán)境DNA還揭示了東江流域水生昆蟲物種多樣性及功能多樣性隨距河口距離變化的趨勢。

海拔是影響物種豐富度最重要的環(huán)境因子（P＜0.01），COD是影響物種豐富度的重要環(huán)境因子（P＜0.05）。海拔、DO、COD是影響功能豐富度的重要環(huán)境因子（P＜0.05）。

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Environmental DNA revealed changes and influencing factors of aquatic insect species diversity in Dongjiang River Basin

YIN Xue1， QIN Shan2， WANG ZongYang2， YIN Xuwang1，ZHANG Yuan2

（1.Liaoning Provincial Key Laboratory of Hydrobiology，College of Fisheries and Life Sciences，Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023 China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Water Quality Improvement and Ecological Restoration for Watersheds，School of Ecology，Environment and Resources，Guangdong Province，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006 China）

Abstract：Taking Dongjiang River Basin as an example，the spatial distribution of aquatic insect community and its environmental influencing factors were explored through environmental DNA technology.The results showed that： 1） The species richness of aquatic insects in descending order was Diptera （7 families）＞ Ephemeroptera （6 families）＞ Trichoptera （2 families） = Odonata （2 families） = Coleoptera （2 families） ＞Lepidoptera （1 family）.Diptera （84.99%） and Ephemeroptera （14.89%） accounted for 99.88% of the total reads， while Chironomidae （69.20%）， Tetrapaetidae （14.36%） and Heliidae （14.26%） accounted for 97.82% of the total reads.2） Species richness index， Shannon Wiener index， Simpson index， functional richness index （FRic） and functional dispersion index （FDiv） were positively correlated with the distance from estuarine. The FEve index of functional evenness was negatively correlated with the distance from estuary. 3） Elevation was the most important environmental factor affecting species richness （P＜0.01）， and COD was the most important environmental factor affecting species richness （P＜0.05）.Elevation， DO and COD were important environmental factors affecting function richness （P＜0.05）.

Key words：Dongjiang River basin; aquatic insects; species diversity; functional diversity; environmental DNA

（收稿日期：2023-01-11）