骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型造模方法的研究進(jìn)展

趙建棟 郭成龍 柴威濤 任行全 畢煦昆 張效收 劉貝

【摘 要】 骨質(zhì)疏松癥是一種全球性疾病。動(dòng)物模型的研究應(yīng)用為人們研究疾病提供了一種切實(shí)有效的方法，病證結(jié)合骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型則可以為中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥提供一個(gè)可行有效且便捷的機(jī)體，避免直接在人體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而產(chǎn)生如倫理學(xué)等一系列問題。收集總結(jié)迄今為止有關(guān)骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型及病證結(jié)合骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀，為研究工作者提供思路。

【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松癥；動(dòng)物模型；造模；病證結(jié)合；證型造模；研究進(jìn)展；綜述

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是指單位體積正常礦化骨的骨量減少，骨基質(zhì)及礦鹽平行減少，骨脆性增加，從而易發(fā)生骨折的一種疾病，主要病因有內(nèi)分泌因素、營養(yǎng)因素、藥物因素等。OP患者既有骨質(zhì)疏松表現(xiàn)又伴隨腰背疼痛、骨折、駝背、功能障礙。OP可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性O(shè)P主要是指退行性骨質(zhì)疏松，可分為Ⅰ型（絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松）和Ⅱ型（老年骨質(zhì)疏松），繼發(fā)性O(shè)P主要包括疾病、藥物或其他原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松［1］。運(yùn)用導(dǎo)致OP的病因可以指導(dǎo)科研工作者進(jìn)行OP動(dòng)物造模，比如切除小鼠雙側(cè)卵巢可復(fù)制絕經(jīng)后OP，小鼠腹腔注射D-半乳糖可以復(fù)制衰老導(dǎo)致的老年性O(shè)P，長期使用大劑量糖皮質(zhì)激素、腿尾固定、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠的糖尿病骨質(zhì)流失等可復(fù)制繼發(fā)性O(shè)P。

1 OP的概況

1.1 中醫(yī)學(xué)對(duì)OP的認(rèn)識(shí) 中醫(yī)學(xué)將OP歸屬于“骨痿”“骨痹”范疇［2］，認(rèn)為腎虛是根本，脾虛是主要病機(jī)，血瘀是病理產(chǎn)物。按照2020《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)》［3］將OP分為陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證、脾胃虛弱證和氣滯血瘀證6個(gè)證型。

1.2 病證結(jié)合動(dòng)物模型常用觀察指標(biāo) OP造模的觀察指標(biāo)有甲狀旁腺激素（PTH）、活性維生素D、降鈣素、骨性堿性磷酸酶（BALP）、Ⅰ型膠原N端前肽（PINP）、骨鈣素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）等［1］。OP新型炎癥指標(biāo)：中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率（NLR）、全身免疫炎癥指數(shù)（SII）與OP、單核細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率（MLR）、血小板/淋巴細(xì)胞比率（PLR）［4］。動(dòng)物OP在骨微結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)上腎陰虛表現(xiàn)為形體消瘦，大便干結(jié)，小便赤黃，自主活動(dòng)增加等；腎陽虛表現(xiàn)為拱背蜷曲，畏寒喜暖，肛溫降低，反應(yīng)遲鈍，呼吸深遲，毛發(fā)干枯，消瘦，尿液清長等；脾腎陽虛表現(xiàn)為毛發(fā)無光澤，掉毛現(xiàn)象，爪甲顏色變淺，大便較稀軟，甚者如水狀等。

2 常規(guī)OP動(dòng)物造模方法

2.1 手術(shù)方法

2.1.1 手術(shù)去勢法 女性因卵巢功能減退致體內(nèi)雌激素水平降低，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子分泌失調(diào)，使得成骨與破骨平衡打破，最終誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（PMOP）［5］，用手術(shù)方法摘除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單側(cè)或雙側(cè)卵巢，可以模擬絕經(jīng)后OP動(dòng)物模型［6］。此法為最常用的PMOP造模方法，可以很好地模擬OP，缺點(diǎn)是直接切除雙側(cè)卵巢導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌激素驟降，與實(shí)際PMOP不符。為了避免出現(xiàn)這種現(xiàn)象，切除單側(cè)卵巢不失為一種改良方法，這種改良也存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)雌激素驟降的問題，但相對(duì)于切除雙側(cè)稍有緩和。手術(shù)去勢法會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成創(chuàng)傷，比如感染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此時(shí)可考慮使用抗生素，但會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂。有人研究腸道菌群與OP相關(guān)［7］，使用抗生素亦可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。手術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能因疼痛導(dǎo)致廢用，使用鎮(zhèn)痛藥物亦或?qū)?shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。手術(shù)去勢法雖是目前PMOP常用造模方法，但其缺點(diǎn)也較為顯著。人類罹患疾病是長期而復(fù)雜的過程，想得到相對(duì)完美的模型將需要長期的探索過程。

2.1.2 坐骨神經(jīng)切斷法 通過手術(shù)方法切斷模型動(dòng)物的單側(cè)或雙側(cè)坐骨神經(jīng)可有效建立廢用性骨質(zhì)疏松癥（DOP）［8］。

2.1.3 脊髓切斷法 脊髓損傷（SCI）常伴有骨盆和下肢病變區(qū)域的OP，增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，通過手術(shù)行椎板切除術(shù)，將脊髓完全橫切可復(fù)制DOP［9］。

2.1.4 臂叢神經(jīng)切除法 黃昌釗等［10］將兔一側(cè)全臂叢神經(jīng)于鎖骨下鏡下分離至神經(jīng)根孔處切斷，造模后發(fā)現(xiàn)肱骨骨密度、干重明顯降低，骨的力學(xué)強(qiáng)度指標(biāo)較對(duì)照側(cè)明顯減弱，表明切除臂叢神經(jīng)可以模擬DOP。

坐骨神經(jīng)切斷、脊髓切斷、臂叢神經(jīng)切除均可模擬DOP，DOP是因?yàn)楣趋罊C(jī)械負(fù)荷力的減少而引起局部或全身骨量丟失［11］，為OP病因之一。通過手術(shù)方法使得模型動(dòng)物骨骼機(jī)械負(fù)荷力減少從而模擬DOP，但是這3種方法也都使用手術(shù)，上述手術(shù)對(duì)OP的影響均有可能發(fā)生。

2.1.5 甲狀旁腺切除法 甲狀旁腺主要功能是分泌PTH，PTH可增強(qiáng)腎小管和腸道對(duì)體內(nèi)鈣的重吸收能力，體內(nèi)鈣和磷的代謝平衡被破壞，導(dǎo)致骨質(zhì)溶解［12］。洪志勇等［13］實(shí)驗(yàn)證明，切除雙側(cè)甲狀旁腺可致大鼠OP。這種手術(shù)難度高，不確定性因素多，相關(guān)報(bào)道較少，能參考的文獻(xiàn)也較陳舊。

2.2 藥物方法

2.2.1 非手術(shù)去勢法 此方法與手術(shù)去勢法都使得機(jī)體雌激素下降，導(dǎo)致PMOP，可以很好地模擬絕經(jīng)后OP動(dòng)物模型［14］。此種方法雖然消除手術(shù)因素構(gòu)建PMOP，但藥物的使用也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2.2 糖皮質(zhì)激素法 糖皮質(zhì)激素是導(dǎo)致OP的重要原因之一，長期大量使用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致成骨細(xì)胞的破壞、破骨細(xì)胞被活化及減少腸道對(duì)鈣磷的吸收［15］。采用灌胃、注射糖皮質(zhì)激素或皮下植入緩釋糖皮質(zhì)激素藥物，通過給予影響動(dòng)物內(nèi)分泌功能的藥物抑制生理狀態(tài)下的雌激素分泌，建立OP模型［16］。袁雪梅等［17］給予雄性Wistar大鼠肌內(nèi)注射潑尼松龍，祝佳音等［18］給予小鼠臀部肌內(nèi)注射地塞米松，通過注射糖皮質(zhì)激素均使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生OP。運(yùn)用糖皮質(zhì)激素可以很好地模擬藥物源性O(shè)P，使用這種方法的人數(shù)較多，相關(guān)文獻(xiàn)比較齊全，此種方法已相對(duì)成熟，可以合理使用。

2.2.3 D-半乳糖模型 D-半乳糖可以導(dǎo)致機(jī)體衰老，腹腔注射D-半乳糖，可以復(fù)制衰老導(dǎo)致的OP［19］。模擬老年性O(shè)P的想法較少，這是相對(duì)常用的一種，研究老年性O(shè)P藥物的科研工作者可以選擇此種方法。

2.2.4 維甲酸模型 維甲酸灌胃造模［20］，維甲酸可降低正常人成骨細(xì)胞活性，抑制成骨細(xì)胞的增殖［21］，刺激破骨細(xì)胞使其活性增強(qiáng)［22］。

2.2.5 谷氨酸單鈉法 谷氨酸單鈉能夠選擇性損害動(dòng)物下丘腦弓狀核神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能紊亂，誘發(fā)骨小梁厚度及數(shù)量減少，進(jìn)而導(dǎo)致骨量減少、骨結(jié)構(gòu)顯著破壞等OP表現(xiàn)，這類OP在學(xué)術(shù)上被稱作腦源性O(shè)P［23］。

2.2.6 乙醇法 乙醇會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞過早衰老，長期大量使用乙醇也可以構(gòu)建OP模型［24］。

2.3 物理方法

2.3.1 X射線 X射線照射則導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂的不同階段均有損傷［25］。

2.3.2 γ射線 電離輻射會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞丟失和卵巢萎縮，使卵巢功能喪失，可模擬圍絕經(jīng)期OP［26］。

采用X、γ射線輻射方法，破壞卵巢功能，使動(dòng)物模型處于圍絕經(jīng)期，消除了手術(shù)、藥物等因素的影響而成功模擬PMOP。

2.3.3 外固定法 有學(xué)者采用喇叭型套筒套入左、右后肢根部，觀察到大鼠股骨的骨小梁體積變小，骨礦物質(zhì)含量等指標(biāo)顯著下降，成功建立OP模型［27］。

2.3.4 懸吊法 又名腿尾固定，后腿抬高頭朝下傾斜30°，人為造成動(dòng)物失重或者模擬失重狀態(tài)，使骨質(zhì)水平降低，鈣磷代謝處于負(fù)平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)丟失［27］。

外固定法和懸吊法單純使用物理方法模擬DOP，消除了手術(shù)、藥物等因素的影響。

2.4 其他方法

2.4.1 吸煙 有研究顯示，戒煙可降低骨量的減少［28］，機(jī)體過度吸入煙草會(huì)對(duì)骨代謝產(chǎn)生有害影響，易患OP。FRANCO等［29］研究發(fā)現(xiàn)，將Wistar大鼠在吸煙箱中被動(dòng)吸煙可致大鼠OP。

2.4.2 基因 超過100種目的基因參與OP發(fā)生、發(fā)展過程，采用基因敲除法可構(gòu)建OP動(dòng)物模型［30］。

2.4.3 鐵超載法 有研究通過注射枸櫞酸鐵銨，將機(jī)體暴露于高鐵環(huán)境下可誘導(dǎo)成骨缺陷，培養(yǎng)出快速、穩(wěn)定的斑馬幼魚和成魚的OP模型，可廣泛用于未來的OP藥物篩選［31］。

2.4.4 鏈脲佐菌素法 鏈脲佐菌素可以誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠的糖尿病骨質(zhì)流失，可在鏡下觀察到大鼠骨小梁密度降低［32］。

2.4.5 冬眠熊 有學(xué)者研究DOP時(shí)對(duì)冬眠熊進(jìn)行相關(guān)研究，提出冬眠熊在冬眠期間為何不發(fā)生OP的疑問。DONAHUE等［33］研究發(fā)現(xiàn)，冬眠熊在冬眠期間每天會(huì)發(fā)生身體顫動(dòng)4～5次，這種輕微的機(jī)械運(yùn)動(dòng)可防止OP的發(fā)生，破壞這種機(jī)械運(yùn)動(dòng)可致冬眠熊患OP。

3 病證結(jié)合OP動(dòng)物模型方法

病證結(jié)合動(dòng)物模型是指將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通過一定的實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)造出既符合西醫(yī)學(xué)疾病的常規(guī)特點(diǎn)，同時(shí)又符合中醫(yī)學(xué)證候特點(diǎn)的特殊造模方法［34］。具體方法是用常規(guī)的OP動(dòng)物造模方法構(gòu)造出大家所公認(rèn)的西醫(yī)學(xué)OP，再通過中醫(yī)證型造模方法構(gòu)造出OP中醫(yī)證型。目前常規(guī)的OP動(dòng)物造模方法甚多，病證結(jié)合OP動(dòng)物模型較少，僅有腎陰虛、腎陽虛、脾腎陽虛3種。腎陰虛表現(xiàn)為形體消瘦、大便干結(jié)、小便赤黃、自主活動(dòng)增加等，有研究者給小鼠灌服甲狀腺片混懸液，注射地塞米松后小鼠會(huì)出現(xiàn)形體消瘦、大便干結(jié)等癥狀［35］，表明小鼠腎陰虛模型已經(jīng)建立。小鼠注射氫化可的松可表現(xiàn)為拱背蜷曲、畏寒喜暖、肛溫降低等腎陽虛癥狀［36］，大黃瀉下法可致小鼠毛發(fā)無光澤、掉毛現(xiàn)象、爪甲顏色變淺、大便較稀軟，甚者如水狀等脾腎陽虛癥狀［37］。利用OP常規(guī)造模加中醫(yī)證型造模方法可建立病證結(jié)合OP動(dòng)物模型。

3.1 腎陰虛 夏炳江等［38］采用手術(shù)去勢法切除昆明小鼠雙側(cè)卵巢，再給小鼠每天灌服甲狀腺片混懸液，之后成功復(fù)制OP腎陰虛病證結(jié)合模型。夏炳江等［39］用地塞米松單一因素構(gòu)建OP腎陰虛小鼠模型，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M注射地塞米松后注射生理鹽水，藥物反證組注射地塞米松后以六味地黃丸混懸液灌胃，模型組小鼠出現(xiàn)了典型OP病理學(xué)表現(xiàn)。模型組出現(xiàn)煩躁不安，活動(dòng)頻繁，毛發(fā)枯槁、無光澤、易脫落，飲水增多，小便赤黃等類似陰虛的表現(xiàn)，而藥物反證組小鼠則表現(xiàn)良好，從而反證出地塞米松可致小鼠腎陰虛，用地塞米松這一單一因素既致小鼠OP又致小鼠腎陰虛。

3.2 腎陽虛 陳劍磨等［40］用手術(shù)去勢法切除昆明小鼠雙側(cè)卵巢后間隔7周，按25 mg·kg-1皮下注射氫化可的松1周，8周時(shí)OP模型和腎陽虛造模同時(shí)結(jié)束。觀察到昆明小鼠出現(xiàn)骨小梁排列稀疏、變細(xì)、微骨折等OP臨床表現(xiàn)，同時(shí)出現(xiàn)了畏寒倦臥、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、體質(zhì)量下降等腎陽虛證候，證明成功建立了OP腎陽虛模型。曹端廣等［41］用維甲酸灌胃、氫化可的松臀部肌內(nèi)注射的方法構(gòu)建腎陽虛OP病證結(jié)合動(dòng)物模型，選取SD大鼠，將維甲酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羧甲基纖維素鈉混合，持續(xù)2周按每日80 mg·kg-1灌胃，并同時(shí)每日按2 mg·kg-1臀部肌內(nèi)注射氫化可的松，模型復(fù)制成功后觀察到模型組大鼠有神疲、發(fā)力、靜臥、小便多等腎陽虛表現(xiàn)，且與空白對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠骨密度顯著降低，證明成功建立了OP腎陽虛模型。

3.3 脾腎兩虛 鄭洪新等［42］證實(shí)切除卵巢可造成腎虛型OP動(dòng)物模型。李燕舞等［43］證實(shí)大黃瀉下法可致大鼠脾虛。劉梅潔等［44］則在前者基礎(chǔ)上先切除大鼠卵巢，在用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200%的大黃濃煎液灌胃，同時(shí)得到脾腎兩虛OP動(dòng)物模型。鄧強(qiáng)等［45］先用手術(shù)去勢法切除大鼠卵巢，再注射氫化可的松加番瀉葉灌胃加飲食失節(jié)加勞倦過度的方法復(fù)制脾腎陽虛OP模型。造模5周后大鼠出現(xiàn)大便清稀如水狀、爪甲顏色變淡、毛發(fā)枯槁無華、尾巴發(fā)涼、弓背蜷臥、喜好抱團(tuán)扎堆等脾腎陽虛癥狀，且模型組大鼠血清骨堿性磷酸酶含量低于正常組和假手術(shù)組，提示模型組大鼠患OP，說明用此法也可成功構(gòu)建脾腎陽虛OP動(dòng)物模型。

4 小結(jié)和展望

OP動(dòng)物模型的建立為探究發(fā)病機(jī)制、病理研究、臨床藥物的開發(fā)應(yīng)用提供了很好的機(jī)體，使對(duì)OP的認(rèn)識(shí)更加清晰。雖然OP造模方法眾多，但是又各有弊端，不能完全模擬人體各種OP，所以科研工作者們應(yīng)當(dāng)集思廣益，繼續(xù)發(fā)掘OP造模方法。中醫(yī)藥雖然對(duì)OP有獨(dú)特的優(yōu)勢，但是在當(dāng)代大環(huán)境下，優(yōu)勢沒有完全展現(xiàn)出來，就如上述OP有多個(gè)中醫(yī)證型，但病證結(jié)合動(dòng)物模型只有腎陰虛、腎陽虛和脾腎陽虛3個(gè)模型。目前，中醫(yī)證型造模方法較多，是否可以按上述病證結(jié)合的原理，盡可能多進(jìn)行一些造模實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步挖掘中醫(yī)藥的優(yōu)勢。我們當(dāng)實(shí)事求是對(duì)一些有瑕疵的方法進(jìn)行改進(jìn)，并繼續(xù)創(chuàng)新方法，以求最理想的動(dòng)物模型。

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收稿日期：2022-12-10；修回日期：2023-01-08

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（18JR3RA074）

作者單位：1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

通信作者：郭成龍