熱激對甜瓜未授粉子房培養(yǎng)胚珠膨大期內(nèi)源激素的影響

唐桃霞　孔維萍　任凱麗　程鴻　張化生

摘要：為探究熱激處理對甜瓜未授粉子房培養(yǎng)中胚珠膨大發(fā)育與內(nèi)源激素的影響，以期為揭示胚珠膨大和單倍體培養(yǎng)的機理研究奠定基礎(chǔ)。以熱激和對照培養(yǎng)不同天數(shù)的甜瓜未受粉子房為試材，對胚珠膨大率進行動態(tài)監(jiān)測，并采用UPLC-ESI-MS/MS法測定順式玉米素核糖核苷（CZR）、赤霉素3（GA3）、反式玉米素（ZT）、吲哚-3-乙酸（IAA）及脫落酸（ABA）含量，并分析了這5種內(nèi)源激素與胚珠膨大發(fā)育的關(guān)系。結(jié)果表明，與對照25 ℃室溫培養(yǎng)相比，32 ℃熱激處理4 d有利于胚珠的膨大及內(nèi)源激素的積累，且在胚珠膨大期5種內(nèi)源激素的變化趨勢一致，均為遞增。各內(nèi)源激素間的比例關(guān)系處于動態(tài)變化中，且在整個膨大期，熱激處理下IAA/（ZT+CZR）、IAA/ABA和IAA/GA3均較對照25 ℃室溫培養(yǎng)高；胚珠膨大率與內(nèi)源激素IAA呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0.818，與ZT、CZR和ABA均呈顯著正相關(guān)，與（ZT+CZR）/GA3呈顯著負相關(guān)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；未授粉子房；胚珠膨大發(fā)育；熱激；內(nèi)源激素

中圖分類號：S652? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）01-0053-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.01.013

Effect of Heat Shock on Endogenous Hormones during Ovule Expansion

in Unpollinated Ovary Culture of Melon

TANG Taoxia， KONG Weiping， REN Kaili， CHENG Hong， ZHANG Huasheng

（Institute of Vegetables， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： In order to explore the effect of heat shock treatment on ovule expansion and endogenous hormones in unpollinated ovary culture of melon， and to lay a foundation for revealing the mechanism of ovule expansion and haploid culture. The unpollinated ovary of melon cultured for different days under the heat shock and control culture was used as the test material， the ovule expansion rate was monitored dynamically， the contents of cis-zeatin ribonucleoside（CZR）， gibberellin 3（GA3）， trans-zeatin （ZT）， indole-3-acetic acid（IAA） and abscisic acid（ABA） were determined by UPLC-ESI-MS/MS method， and the relationship between these 5 endogenous hormones and ovular expansion was analyzed. The results showed that heat shock treatment was beneficial to ovule enlargement and accumulation of endogenous hormones compared with the control culture at 25℃， and the changes of 5 endogenous hormones in ovule enlargement stage were consistent and increased. The proportional relationship between the hormones was in dynamic change， and the ratios of IAA/（ZT+CZR）， IAA/ABA and IAA/GA3 under heat shock treatment were higher than the control throughout the expansion period. The ovule expansion rate was significantly positively correlated with the endogenous hormone IAA（the correlation coefficient was 0.818）， and was significantly positively correlated with ZT， CZR and ABA， but was negatively correlated with （ZT+CZR）/GA3.

Key words： Melon; Unpollinated ovary; Ovule expansion; Heat shock; Endogenic hormone

單倍體育種技術(shù)可以突破傳統(tǒng)選系周期長進度慢的局限［1 - 2 ］，而瓜類作物單倍體育種常采用離體雌核培養(yǎng)途徑。離體雌核發(fā)育（in vitro gynogenesis）是指通過未受精子房或胚珠的離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)大孢子或雌配子細胞分裂形成胚狀體或經(jīng)由愈傷組織形成胚狀體，最終產(chǎn)生單倍體（haploid）或雙單倍體（doubled? haploid）植株的過程。為此，前人針對離體雌核發(fā)育的影響因素展開了大量研究，如基因型、外植體發(fā)育時期、預(yù)處理、培養(yǎng)基組成成分和培養(yǎng)條件等，均取得了突破性的進展［3 - 5 ］，但由于離體雌核培養(yǎng)影響因素眾多，發(fā)育機制尚不明確，導(dǎo)致誘導(dǎo)技術(shù)存在低效性和不可復(fù)制性，因而嚴重影響育種應(yīng)用。

熱激處理作為離體雌核培養(yǎng)預(yù)處理的一種有效方式［6 ］，在葫蘆科作物甜瓜、黃瓜、南瓜等方面均有報道［7 - 9 ］，但對其控制單倍體化過程的分子和生理機制知之甚少。Zhu等 ［10 ］研究發(fā)現(xiàn)，西瓜未受精胚珠在熱激誘導(dǎo)下，其植物激素等相關(guān)基因的表達變化可能是誘導(dǎo)未受精胚珠發(fā)育的重要因素，然而在甜瓜中熱激是如何影響未受粉子房（胚珠）發(fā)育和激素變化的還未見報道。為此，我們分析了甜瓜未受粉子房培養(yǎng)胚珠膨大過程中相關(guān)激素的動態(tài)變化規(guī)律，以期為揭示胚珠膨大和單倍體培養(yǎng)的機理研究奠定基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

指示甜瓜品種為厚皮甜瓜自交系C29，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所西甜瓜研究室提供。

1.2? ?試驗方法

以厚皮甜瓜自交系C29開花前1 d未授粉的子房為外植體。外植體經(jīng)流水沖洗后去掉表皮置于無菌操作臺，75%乙醇震蕩消毒30 s，橫切成約1～2 mm薄片，5% NaClO 震蕩消毒10 min，無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干水分后接種到pH 為5.8的MS培養(yǎng)基［MS+30 g/L Suc（蔗糖）+8.0 g/L Agr（瓊脂）+0.06 mg/L TDZ（噻苯?。?20.00 mg/L AgNO3（硝酸銀）+0.5 g/L CH（水解酪蛋白）］上，分成兩組，一組置于25 ℃室溫培養(yǎng)（對照，C），另一組置于32 ℃熱激處理4 d（H）［6 ］，然后轉(zhuǎn)入對照條件下一同培養(yǎng)。晝/夜光周期均為16 h/8 h，分別于開始培養(yǎng)2 d（C1和H1）、4 d（C2和H2）、7 d（C3和H3）、12 d（C4和H4）、20 d（C5和H5）后取樣，每處理取8瓶為混合樣，3次重復(fù)，取樣前統(tǒng)計觀察胚珠膨大發(fā)育情況。

1.3? ?測定方法

1.3.1? ? 樣品前處理? ? 樣品前處理主要包括激素提取、固相萃取、濃縮復(fù)溶。詳細步驟按照胡盼盼等［11 ］和Liu等［12 ］的方法，激素提取步驟略有改動，準確稱取 0.5 g 液氮研磨好的樣品于 10 mL 離心管中，加入鋼珠，加入 2.5 mL 提取液（甲醇、水、甲酸按體積比7.9∶2.0∶0.1配制，含少量抗氧化劑），破碎 3 min 以上；冰上超聲 30 min，4 ℃浸提 12 h；離心（4 ℃，12 000 rpm，20 min）后取上清；濾渣中加入 2.0 mL 提取液，冰上超聲 30 min，混勻離心，4 ℃浸提 1 h；離心（4 ℃，12 000 rpm，20 min）后取上清，合并浸提液。

1.3.2? ? 上機檢測? ? 采用 UPLC-ESI-MS/MS 分析方法，對IAA（吲哚-3-乙酸）、ZT（反式玉米素）、CZR（順式玉米素核糖核苷）、GA3（赤霉素3）和ABA（脫落酸）含量進行定量檢測。液相色譜條件和質(zhì)譜條件參照胡盼盼等［11 ］的方法，進樣量略有改動，為1.0 μL。CZR、GA3、ZT、IAA、ABA出峰時間分別為1.64、1.68、1.70、1.92、2.08 min，吸收峰之間分離良好，互不干擾，說明本實驗提取方法和檢測條件較為可靠。通過計算各內(nèi)源激素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，標準品濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，關(guān)聯(lián)度較高，符合后續(xù)數(shù)據(jù)分析需要（表1）。

1.4? ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Execl 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理和計算，采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?未受粉子房培養(yǎng)胚珠膨大率變化

胚珠膨大是未受粉子房培養(yǎng)發(fā)育過程的第一步。培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，甜瓜未受粉子房培養(yǎng)的胚珠膨大至20 d時膨大率達最高，因此，胚珠膨大期實驗以0～20 d為期限。取樣前統(tǒng)計觀察培養(yǎng)不同天數(shù)32 ℃熱激處理4 d和對照25 ℃室溫培養(yǎng)的胚珠膨大發(fā)育情況，由表2可知，同一處理胚珠膨大率隨著培養(yǎng)時間的增加而提高，熱激處理和對照最大增幅分別為93.00%、80.00%；同一時期，除培養(yǎng)2 d（C1和H1）外，其余培養(yǎng)時間下熱激處理的胚珠膨大率均較對照高，增幅為12.85～27.77個百分點。上述結(jié)果初步說明熱激有利于甜瓜未受粉子房的胚珠膨大。

2.2? ?胚珠膨大期內(nèi)源激素含量動態(tài)變化

由表3可知，隨著胚珠的膨大，5種內(nèi)源激素變化均為遞增趨勢。其中IAA變化幅度最大，熱激處理變幅為51.71～138.17 ng/g，對照變幅為31.94～91.98 ng/g，同一時期熱激處理較對照IAA含量差異顯著，差異為19.77～46.19 ng/g。內(nèi)源ZT含量熱激處理變幅為9.05～19.00 ng/g，對照變幅為7.29～16.93 ng/g。CZR隨著胚珠的膨大逐漸升高，培養(yǎng)前期（2～12 d）對照均較熱激處理高，但到胚珠膨大后期（20 d），熱激處理的胚珠內(nèi)源CZR大幅升高，且較對照的含量高3.75 ng/g。ABA的變化趨勢恰好與CZR相反，培養(yǎng)前期（2～7 d）熱激處理均較對照的高，但到胚珠膨大中后期（12～20 d）對照胚珠內(nèi)源ABA大幅升高，且分別較熱激處理的含量高出4.92（12 d）、24.72 ng/g（20 d）。GA3含量熱激處理變幅為17.25～78.85 ng/g，對照變幅為19.24～83.74 ng/g，且除培養(yǎng)第7 d時熱激處理較對照高外，其余時期均表現(xiàn)為對照較熱激處理高。綜上可知，熱激處理能顯著影響甜瓜胚珠膨大期內(nèi)源激素的變化，與對照相比，可提高甜瓜胚珠膨大期IAA和ZT的含量。

2.3? ?內(nèi)源激素間的比例關(guān)系

內(nèi)源性植物激素是植物體自身合成的、控制其生長發(fā)育的一類微量或痕量信號分子［13 ］，對植物生長發(fā)育的整個過程發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而決定生理效應(yīng)的往往不是某種激素的絕對量，而是各激素間相互作用的結(jié)果［14 - 15 ］，因此，本研究對胚珠膨大期的5類激素間的動態(tài)平衡進行了分析比較，結(jié)果如圖1所示。各激素間的平衡狀態(tài)處于動態(tài)變化中，其中熱激處理和對照的（ZT+CZR）/IAA值變化趨勢基本一致，均為先下降，在12 d時降至最低，然后又上升，且在整個膨大期對照的（ZT+CZR）/IAA值均較熱激處理的高，說明熱激處理可能促進IAA產(chǎn)生（圖1-A）。對照的（ZT+CZR）/ABA值逐漸降低，熱激處理的變化趨勢為“W”型，而在剛開始2 d時熱激處理和對照的比值接近，熱激培養(yǎng)過程中（ZT+CZR）/ABA值下降，轉(zhuǎn)到對照條件下后開始上升，說明熱激處理可能增加雌核內(nèi)ABA的含量（圖1-B）。熱激處理的（ZT+CZR）/GA3值變化趨勢基本為逐漸下降，僅在12 d時有所上升，變化范圍在0.37～0.62，對照的（ZT+CZR）/GA3值變化趨勢也為逐漸下降，僅在7 d時有所上升，（ZT+CZR）/GA3值變化范圍為0.28～0.51（圖1-C）。對照的GA3/ABA值變化趨勢為先上升后下降，在4 d時最高；熱激處理的變化趨勢為“W”型趨勢（圖1-D）。對照的IAA/ABA值逐漸下降，熱激處理的IAA/ABA值先下降后上升，在4 d時最低，且在整個膨大期內(nèi)，熱激處理的IAA/ABA值均高于對照（圖1-E）。熱激處理的IAA/GA3值變化趨勢為先下降后上升再下降，對照的IAA/GA3值基本平穩(wěn)，且在整個膨大期內(nèi)，熱激處理的IAA/GA3值均高于對照（圖1-F）。綜上所述，熱激處理會增加IAA含量，進而促進胚珠膨大。

2.4? ?胚珠膨大與內(nèi)源激素相關(guān)性分析

對胚珠膨大率與5種內(nèi)源激素以及內(nèi)源激素之間的相關(guān)程度進行分析的結(jié)果（表4）表明，甜瓜胚珠膨大期其胚珠膨大率與內(nèi)源激素IAA呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.818；與ZT、CZR、ABA均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.755、0.706、0.732；與（ZT+CZR）/GA3呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.651；與其余指標均有不同程度的相關(guān)性，但均未達到顯著；胚珠膨大期內(nèi)各內(nèi)源激素間也具有一定的相關(guān)性，如IAA與ZT、CZR、ABA之間均呈極顯著正相關(guān)；ZT與CZR、ABA均呈極顯著正相關(guān)，與GA3呈顯著正相關(guān)；CZR與ABA呈極顯著正相關(guān)，與（ZT+CZR）/GA3呈顯著負相關(guān)；GA3與ABA呈極顯著正相關(guān)，與（ZT+CZR）/ABA呈極顯著負相關(guān)，與（ZT+CZR）/GA3呈顯著負相關(guān)；ABA與（ZT+CZR）/GA3呈極顯著負相關(guān)。

3? ?討論與結(jié)論

植物離體培養(yǎng)的理論與實踐證明，培養(yǎng)基中添加的外源激素是通過內(nèi)源激素水平來起作用的［16 ］，越來越多的研究也表明植物生長發(fā)育的各個階段都受到內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)與控制［17 ］。本研究結(jié)果表明，在胚珠膨大期，內(nèi)源激素CZR、GA3、ZT、IAA和ABA含量均直線上升，且熱激處理的雌核膨大率及IAA和ZT含量均較對照室溫培養(yǎng)的高。前人研究表明，在胚誘導(dǎo)期間進行熱激處理，對于單倍體胚胎形成可能有益，且熱激（32 ～ 35 ℃）處理對瓜類作物的子房和胚珠培養(yǎng)起到積極作用［6，18 ］；朱迎春等［19 ］也研究表明，熱激處理可能增加了子房細胞的活躍程度，且熱激蛋白、植物激素和胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達變化可能是誘導(dǎo)未受精胚珠發(fā)育的重要因素。

各類植物激素的生理作用具有相對專一性，但植物的各種生理反應(yīng)是不同種類植物激素相互作用的結(jié)果，在體胚發(fā)生過程中，植物激素的平衡是調(diào)控胚胎發(fā)育的重要條件［20 ］。從本研究結(jié)果來看，胚珠膨大期內(nèi)，熱激處理的IAA/（ZT+CZR）值、IAA/ABA和IAA/GA3值均較對照室溫培養(yǎng)的高，說明高比例的IAA有利于促進細胞膨大（胚珠的膨大），這與吳貝等［21 ］和劉曉曉等［22 ］研究結(jié)果相似。張亞芳等［23 ］研究發(fā)現(xiàn)IAA/ABA 呈先降后升趨勢，對芽的分化與生長有著重要的促進作用，本研究中對照室溫培養(yǎng)的IAA/ABA值逐漸下降，而熱激處理的先下降后上升，推測熱激更有利于胚狀體形成。

由胚珠膨大率和各激素間的相關(guān)性分析可知，甜瓜胚珠膨大期內(nèi)其胚珠膨大率與內(nèi)源激素IAA呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0.818，這進一步證明IAA是參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要激素，影響細胞的擴增和分裂、細胞的伸長和分化以及多種生理反應(yīng)［24 ］；且與ZT、CZR和ABA也均呈顯著正相關(guān)，與（ZT+CZR）/GA3呈顯著負相關(guān)，說明未授粉胚珠膨大是由多種內(nèi)源激素共同作用的。

綜上，胚珠膨大期各內(nèi)源激素的含量、變化規(guī)律以及平衡關(guān)系對胚珠的膨大發(fā)育具有重要的調(diào)控功能，熱激處理較對照更有利于胚珠的膨大及IAA和ZT含量的積累。此外還發(fā)現(xiàn)，胚珠膨大率與IAA呈極顯著正相關(guān)，與ZT、CZR和ABA均呈顯著正相關(guān)，這為單倍體形成的機理研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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收稿日期：2022 - 10 - 14；修訂日期：2022 - 11 - 09

基金項目：甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中青年基金（2020GAAS44）；甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物育種專項（2022GAAS05）。

作者簡介：唐桃霞（1988 — ），女，甘肅臨洮人，助理研究員，主要從事西甜瓜育種工作。Email： tangtaoxia@126.com。

通信作者：孔維萍（1975 — ），女，甘肅永靖人，副研究員，主要從事西甜瓜育種工作。Email： wpk33@126.com。