短鏈脂肪酸改善脊髓損傷引起的肝臟功能異常*

荊瀛黎,王秋穎,白 帆,李 彥,楊德剛,于 艷

中國康復科學所/中國康復研究中心/神經損傷與康復北京市重點實驗室/北京腦重大疾病研究院神經損傷與修復研究所,北京 100068

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重致殘性疾病,1990-2016年間全球神經系統疾病的負擔研究顯示,2016年全球約有93萬例新發SCI患者,中國有9.8萬例新發患者,中國累計有373萬例SCI患者[1],給家庭和整個社會造成巨大的負擔。SCI后循環系統、肺、腎和肝臟中趨化因子和白細胞迅速升高,引發全身炎癥反應,這種全身反應可能導致SCI后的急性期和慢性期的器官/系統功能障礙[2-4]。有研究發現,SCI后肝臟異常最先發生,隨后加劇脊髓組織的病理損傷[5],這些數據表明肝臟在SCI后引發和延長全身炎癥方面起著關鍵作用。

短鏈脂肪酸(SCFAs)為碳原子數小于6的飽和脂肪酸,主要由腸內厭氧菌發酵膳食纖維等不可消化碳水化合物產生的終產物,其中乙酸、丙酸和丁酸占SCFAs體內含量的95%以上,三者摩爾比約為60∶20∶20[6]。SCFAs是結腸的重要能量來源[7],也作為關鍵信號分子參與宿主健康和疾病的調節,如影響免疫功能、維護腸道屏障功能、調節代謝功能等[8]。研究表明,SCFAs通過調節天然免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞及樹突細胞的募集和遷移,調節T細胞和B細胞的分化,影響免疫應答和炎癥反應[9]。在急性炎癥中,SCFAs通過菌群代謝-肝臟-免疫的相互作用影響腸道屏障和肝臟損傷[10]。鑒于SCFAs在改善腸道黏膜屏障功能和調節免疫方面的特殊作用,本研究通過觀察SCFAs對SCI小鼠肝臟炎癥細胞浸潤、細胞因子表達及脂質代謝的影響,闡述SCFAs對SCI小鼠模型肝臟損傷的調節作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雌性C57BL/6小鼠30只(北京維通利華公司),體重18～22 g,將其按照隨機數字表法分為假手術(Sham)組、SCI組及SCFAs干預(SCI+SCFAs) 組,每組10只。動物飼養于室溫(23±3)℃,相對濕度(55±10)%的環境中,12 h∶12 h明暗交替,動物自由飲水、進食。實驗設計和實驗操作均符合首都醫科大學動物倫理和福利委員會的要求,并審查批準(倫理號:AEEI-2022-111)。

1.1.2主要試劑與儀器 RNA提取液(Servicebio公司);HyPureTMMolecular Biology Grade Water(HyClone公司);Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit(Servicebio公司);2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)(Servicebio公司);引物(Servicebio公司);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)檢測試劑盒(深圳雷杜生命科技公司);三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司);熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(Bio-Rad公司);Chemray420全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科技公司);PSI脊髓損傷打擊器(Precision Systems and Instrumentation公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠SCI模型建立 2%異氟烷麻醉小鼠,進行手術固定并備皮,以T10為中心縱向切口,暴露T9～T11棘突及椎板,行T10椎板切除術,暴露脊髓。利用IH-0400打擊器制作SCI模型,打擊后,生理鹽水沖洗,加入明膠海綿,逐層縫合。將小鼠放入保溫箱內直至蘇醒,術后皮下注射林格液0.5 mL,連續5 d,每天給予下腹部按摩擠壓膀胱2～4次幫助排尿和排便,直至排尿反射恢復。

1.2.2實驗分組 Sham組僅行椎板切除術,不進行脊髓打擊;SCI組接受椎板切除術和脊髓打擊造模;SCI+SCFAs組進行脊髓打擊后給予SCFAs干預,即在小鼠飲水中添加SCFAs(25.9 mmol/L丙酸鈉,40 mmol/L丁酸鈉和67.5 mmol/L乙酸鈉),持續4周。

1.2.3RT-qPCR檢測 損傷后4周,取出肝臟組織,提取肝臟組織中總RNA,利用Nanodrop測量總RNA的濃度與純度。按照試劑盒說明書指導進行逆轉錄,以得到的cDNA樣品為模板,配制20 μL PCR反應體系。PCR擴增程序為:95 ℃預變性30 s,循環1次;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環40次。采用2-ΔΔCt定量分析目的基因表達,ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參),ΔΔCt=ΔCt(處理組)-ΔCt(對照組)。肝組織中CD68、白細胞介素(IL)-1α、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNFα)、固醇調節元件結合蛋白1(SREBP-1)、乙酰輔酶A羧酸化酶(ACC)、肝X受體α(LXRα)和過氧化物酶體增殖激活物受體α(PPARα)的mRNA水平采用RT-qPCR法進行檢測,具體引物信息見表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.4血液生化指標檢測 損傷后4周,每只動物通過心臟采集0.5 mL小鼠血液標本,3 000 r/min低溫離心10 min,取上清液,采用Chemray420全自動生化分析儀檢測血清TG、CHO和ALT水平。實驗操作嚴格按照說明書執行。

2 結 果

2.1SCFAs對SCI小鼠肝臟免疫炎癥的調節作用 與Sham組相比,SCI組肝臟CD68 mRNA表達顯著上調(P<0.05);與SCI組相比,SCI+SCFAs組肝臟CD68 mRNA表達顯著下調(P<0.05),見圖1A。肝臟組織中炎癥因子檢測結果顯示,3組IL-1α和IL-1β 水平比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖1B、C;SCI組TNFα mRNA表達較Sham組顯著上調(P<0.05),SCI+SCFAs組TNFα mRNA表達較SCI組顯著下調(P<0.05),見圖1D。

2.2SCFAs對SCI小鼠脂肪代謝的影響 SCI后3 d小鼠體重顯著下降(P<0.05),之后體重呈上升趨勢。與Sham組相比,SCI組損傷后的1個月內體重顯著降低(P<0.05);SCFAs干預后21 d和28 d,SCI+SCFAs組體重與SCI組相比顯著升高(P<0.05),見圖2A。肝臟比重、血清TG和CHO水平檢測結果顯示,與Sham組相比,SCI組小鼠肝臟比重、血清TG水平顯著降低(P<0.05);但SCI組與SCI+SCFAs組血清TG水平和肝臟比重差異無統計學意義(P>0.05),見圖2B、C;3組血清CHO水平比較差異均無統計學意義(P>0.05),見圖2D。

2.3SCFAs對SCI小鼠脂肪代謝基因的影響 為檢測SCFAs影響肝臟脂代謝的分子機制,本研究檢測肝臟中參與脂代謝的多種基因,如固醇調節元件結合蛋白1(SREBP-1)、乙酰輔酶A羧酸化酶(ACC)、肝X受體α(LXRα)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的mRNA表達情況。SCI后,SREBP1和ACC mRNA水平顯著降低(P<0.05);與SCI組相比,SCI+SCFAs組SREBP1和ACC mRNA水平顯著上調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3A、B;但3組LXRα 和PPARα mRNA水平差異均無統計學意義(P>0.05),見圖3C、D。

2.4SCFAs對SCI小鼠血清ALT的調節作用 對小鼠血清ALT水平檢測結果顯示,與Sham組比較,SCI組血清ALT顯著上調(P<0.05),與SCI組相比,SCI+SCFAs組 ALT水平顯著下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注:A為體重;B為肝臟比重;C為TG;D為CHO;**P<0.01,#P<0.05,##P<0.01,ns表示差異無統計學意義。

注:A為SREBP-1;B為ACC;C為LXRα;D為PPARα;*P<0.05,**P<0.01。

注:*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

脊髓損傷可觸發全身炎癥反應,并引起傷后繼發性臟器損害。肝臟功能受到發自腦干的副交感神經和中下胸段脊髓發出的交感神經調節,T10以上節段SCI會損傷肝臟的自主神經支配,進而影響肝臟的正常功能。因此,肝臟病理性損傷是SCI常見的臨床特征。研究發現,SCI后,肝臟內白細胞數目和細胞因子水平顯著升高[11]。一項臨床研究數據顯示,超過70%的SCI患者出現肝臟的異常改變[12]。有研究顯示,SCI患者肝炎或肝硬化的患病率是普通人的7倍[13]。本研究結果表明,SCI能夠誘導肝臟炎癥和病理損傷至少持續至損傷后4周。SCI誘導的肝臟病理變化包括巨噬細胞的激活、炎癥細胞因子的表達升高,以及脂質代謝異常;而SCFAs能夠部分逆轉SCI后誘導的肝功能異常。肝臟組織中的特殊巨噬細胞——Kupffer細胞與肝細胞損害程度密切相關,CD68是Kupffer細胞表面標志物,可反映Kupffer細胞的活化水平。本研究結果表明,SCFAs可顯著減低SCI后肝臟TNFα和CD68 mRNA水平,抑制肝臟內巨噬細胞活化和降低炎癥細胞因子水平,發揮保護肝臟組織的作用。

肝臟作為脂肪代謝的重要器官,在脂類的消化、吸收、分解等代謝過程中均起重要作用。脂代謝異常與炎癥關系密切,肝臟特異性免疫細胞浸潤與促炎細胞因子表達可促進脂肪代謝性疾病的發生發展[14]。本研究結果顯示,SCI后,小鼠肝臟比重和血清TG水平下調(P<0.05)。而臨床數據報道,76%的SCI患者會出現至少一項脂質代謝參數異常,如TG、CHO、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等異常升高[15-16]。本研究中,SCI后脂質代謝參數并沒有異常升高,可能與損傷的嚴重程度或觀察期長短有關。本研究結果顯示,SCFAs干預后,血清TG水平、脂肪酸合成代謝相關基因SREBP1和ACC mRNA水平升高,表明SCFAs可能通過上調SREBP1和ACC mRNA水平影響肝臟的脂代謝。這可能因為SCFAs干預緩解了肝臟免疫炎癥反應,通過調節脂肪代謝相關基因的表達從而使脂代謝趨于正常,從而促進體重增加。

血清ALT是肝臟中一種豐富的代謝酶,常被用作檢測肝臟損傷的指標。肝臟細胞受損導致ALT在循環中累積,血清ALT升高通常意味著肝臟受損[17]。本研究發現,SCI后4周血清ALT水平顯著升高,這表明隨著肝臟局部病理反應變成慢性疾病過程,肝臟逐漸失去了減輕損傷和實施修復的能力。而SCFAs干預后通過其抗炎和調節脂代謝的作用,減輕肝細胞的損害程度,顯著降低ALT水平。研究數據提示,SCFAs可改善SCI后肝功能指標,對肝臟損傷有一定的保護作用。肝臟在全身炎癥反應的播散過程中起到了至關重要的作用,改善SCI后肝臟功能對減輕其臨床并發癥、改善預后具有重要意義。

本研究尚有一些不足之處,研究周期較短,未對SCI后SCFAs干預效果進行長期觀察;后續研究將長期觀察SCFAs對SCI肝臟的保護效果,深入探討其對SCI后其他并發癥的調節作用。

研究表明,SCFAs在中樞神經系統疾病治療中也發揮重要作用[18-21]。在大腦中動脈遠端永久性閉塞動脈模型中,SCFAs給藥能夠抑制小膠質細胞活化并減少其數量,顯著降低腦中淋巴細胞侵襲,促進神經功能恢復[18]。在多發性硬化的患者中補充SCFAs,可顯著升高IL-10水平,降低IL-17和γ干擾素水平,逆轉Treg細胞與Th17細胞數量的不平衡,降低全身性免疫反應,改善疾病的癥狀[19]。

綜上所述,SCFAs可改善脊髓損傷引起的肝臟損傷,對肝臟具有保護作用,可能有利于神經功能的修復。