1例M蛋白干擾電化學發(fā)光檢測的處理與分析*

汪 玲,李慧明,張 慶,葉斌華,張 青△

南昌大學第一附屬醫(yī)院:1.核醫(yī)學科;2.檢驗科,江西南昌 330006

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以單克隆漿細胞惡性增殖伴單克隆免疫球蛋白大量分泌為特征的惡性漿細胞病,產(chǎn)生的M蛋白沉積可引起患者骨質(zhì)破壞、腎功能損害、感染、貧血、高黏滯綜合征等多種非特異的復雜臨床表現(xiàn)。M蛋白具有獨特均一的物理特性,且多無免疫功能,但可在特定條件下干擾實驗室檢測。近年來關于M蛋白干擾常規(guī)生化免疫檢測的報道屢見不鮮[1-2],涉及比色法及濁度法等多種生化免疫分析方法,亦有M蛋白在化學發(fā)光免疫檢測中產(chǎn)生干擾的案例[3]。M蛋白根據(jù)免疫球蛋白的類型可分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD,以及輕鏈型、雙克隆型和不分泌型。產(chǎn)生檢測干擾的免疫球蛋白以IgG和IgM為主,IgA型M蛋白雖在臨床發(fā)病率較高,但發(fā)生檢測干擾的現(xiàn)象十分罕見。本文報道了本院近期發(fā)現(xiàn)的1例IgA型M蛋白干擾維生素B12(VB12)電化學發(fā)光檢測的個案及消除干擾的方法。

1 資料與方法

1.1臨床資料 患者,男,49歲,雙眼視力無痛性下降10 d,加重6 d伴乏力,擬以“糖尿病性視網(wǎng)膜病變(雙)”收入本院眼科治療。既往發(fā)現(xiàn)有糖尿病史10余天,口服格列美脲,1片/次,1次/天。查體示神清,精神差,自主體位,中度貧血貌;鼻腔牙齦有出血;全身淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。多層螺旋CT掃描顯示雙側(cè)多根肋骨骨質(zhì)破壞并軟組織腫塊,多個胸椎體及附件、左側(cè)肩胛骨內(nèi)斑片狀低密度影,考慮惡性病變。實驗室檢查血常規(guī)示:白細胞計數(shù)(WBC)2.89×109/L,紅細胞計數(shù)(RBC)1.69×1012/L,血小板計數(shù)(PLT) 93×109/L,血紅蛋白(Hb)53 g/L,平均紅細胞體積(MCV)107.1 fL,平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)31.4 pg,平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)293 g/L;生化指標:總蛋白(TP)138.9 g/L,清蛋白(ALB)25.0 g/L,球蛋白(GLB) 113.9 g/L,ALB/GLB 0.22,肌酐(CR)111.1 μmol/L,尿酸(UA)475.7 μmol/L;免疫球蛋白+補體:IgG 5.20 g/L,IgA 88.40 g/L,IgM 0.17 g/L;貧血三項檢測:鐵蛋白619.70 μg/L,葉酸12.05 ng/mL,VB12不能檢測,儀器報警“標本有凝塊”;血清蛋白電泳:γ球蛋白70.7%;免疫固定電泳:IgA,κ泳道發(fā)現(xiàn)異常條帶,分型為IgAκ型;游離輕鏈檢測:游離κ輕鏈>183.00 mg/L;輕鏈κ 9 740.00 mg/dL;骨髓瘤免疫分型可見31.43%異常克隆性漿細胞;骨髓細胞形態(tài)學考慮MM骨髓象。臨床主要診斷為MM(IgAκ型)。

1.2方法

1.2.1標本處理 使用分離膠真空采血管采集患者肘部靜脈5 mL,室溫放置待血液完全凝固后3 000 r/min離心5 min,收集血清,血清鐵蛋白、葉酸和VB12檢測均采用羅氏Cobas e602全自動免疫分析儀(電化學發(fā)光法),檢測試劑均采用原裝配套試劑。

1.2.2確認干擾VB12檢測原因 VB12檢測時儀器報警“標本有凝塊”結(jié)合該患者血液樣本試管存在分離膠不翻轉(zhuǎn)上浮的現(xiàn)象,考慮以下原因:(1)樣本量太少;(2)真空管分離膠質(zhì)量問題;(3)離心機的轉(zhuǎn)速不夠?qū)е卵逦赐耆龀?(4)患者標本中存在異常的血液成分。為探究干擾原因,統(tǒng)計近3天分離膠不翻轉(zhuǎn)的標本例數(shù),加大樣本離心轉(zhuǎn)速至分離膠上浮,分離出血清后再進行檢測。

1.2.3消除干擾的方法 稀釋法:根據(jù)羅氏VB12試劑說明書建議的稀釋基質(zhì),分別采用羅氏DU稀釋液和已知低值血清(VB12<50 pg/mL)對患者血清進行倍比稀釋(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32),并比較兩種稀釋方式所換算的VB12檢測值。聚乙二醇 PEG6000 蛋白沉淀法:將250 g/L PEG6000與患者血清等比例混合,渦旋30 s,室溫下靜置15 min,以 10 000×g離心5 min,取上清液檢測VB12,同時選取5份非免疫球蛋白增高的患者標本作為對照,計算此方法的樣本回收率。

1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件,采用配對t檢驗比較兩種基質(zhì)稀釋后的檢測結(jié)果,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1近3天分離膠不翻轉(zhuǎn)標本統(tǒng)計 統(tǒng)計核醫(yī)學科近3天5 028例患者血液標本發(fā)現(xiàn)分離膠不上浮標本3例,只占總例數(shù)的0.06%。

2.2加大離心機轉(zhuǎn)速至分離膠上浮后的檢測結(jié)果 將離心機轉(zhuǎn)速由3 000 r/min提高至4 200 r/min(離心時間5 min)時,試管分離膠上浮,析出足量清亮、透明血清,無肉眼可見凝塊;將樣本再次上機檢測,VB12仍不能檢測,儀器報警提示“標本有凝塊”。

2.3兩種基質(zhì)稀釋的VB12檢測結(jié)果比較 采用羅氏DU稀釋液和已知低值血清(VB12<50 pg/mL)兩種基質(zhì)倍比稀釋后,所換算的VB12檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種基質(zhì)稀釋的VB12檢測結(jié)果比較(pg/mL)

2.4PEG6000蛋白沉淀法結(jié)果及回收率 蛋白沉淀法VB12檢測換算值(檢測值×2)為918.2 pg/mL,5份對照患者標本的回收率分別為94.3%、103.5%、93.5%、92.2%和91.2%,見表2。樣本回收率高,提示該方法處理樣本所得測定值可靠。

表2 PEG6000蛋白沉淀法VB12檢測結(jié)果及對照標本回收率

3 討 論

VB12也稱鈷銨素,是一種水溶性的有機金屬化合物,人體不能合成,其主要來源于肉蛋奶及魚類制品。人體胃腸道對VB12的吸收取決于胃壁細胞合成的內(nèi)因子。貧血是MM患者的常見癥狀,血清VB12缺乏在MM貧血患者中普遍存在[4],故檢測MM患者的血清VB12水平十分重要。

患者標本VB12檢測時儀器報警提示“標本有凝塊”,結(jié)合分離膠采血管血液分離異常,分離膠未上浮的現(xiàn)象,筆者統(tǒng)計近3天核醫(yī)學科患者標本分離膠未上浮比例僅為0.06%,初步排除離心機的轉(zhuǎn)速不夠的推測,若為分離膠質(zhì)量問題,會出現(xiàn)此批次大量分離膠不上浮的情況,排除分離膠質(zhì)量問題;加大標本離心轉(zhuǎn)速后分離膠上浮,血清析出,但VB12仍未檢出,提示患者血液標本可能存在異常血液成分使血清密度增加。

MM產(chǎn)生的大量M蛋白會引起血清蛋白質(zhì)成分的變化,進而導致血清密度增加[5]。多中心臨床研究發(fā)現(xiàn),MM患者大多存在分離膠位置改變的血液分離不良現(xiàn)象,此現(xiàn)象可提示MM的診斷[6]。該患者血液中存在大量IgA型M蛋白,易形成二聚體為主的多種聚合體,以聚合物形式存在的M蛋白可使患者出現(xiàn)黏滯血癥,干擾檢測吸樣[7];羅氏Cobas e602標本針吸取樣本為壓力感應,吸樣時阻力超出閾值即引起儀器報警,此阻力大小與樣本的吸樣量有關,因此只造成了VB12檢測報警。

根據(jù)文獻報道,采用稀釋法和聚乙二醇PEG6000蛋白沉淀法對樣本進行處理以消除M蛋白對檢測的干擾[8]。為最大限度地降低“基質(zhì)效應”引起的VB12檢測誤差,采用羅氏DU稀釋液和已知低值血清分別進行稀釋檢測,結(jié)果表明兩種基質(zhì)的檢測結(jié)果無明顯差異,但兩種基質(zhì)的倍比稀釋結(jié)果呈現(xiàn)非線性,筆者暫無法判斷此結(jié)果是“基質(zhì)效應”的影響還是血清中高濃度M蛋白對VB12檢測的內(nèi)源性干擾。蛋白沉淀法對照標本蛋白沉淀法的回收率為91.2%～103.5%,回收率高,該方法處理樣本后的測定值可靠;以蛋白沉淀法檢測結(jié)果為參照,比較倍比稀釋結(jié)果,筆者發(fā)現(xiàn)低稀釋倍數(shù)時VB12檢測結(jié)果異常增高,但隨著稀釋倍數(shù)增加其檢測值與蛋白沉淀法結(jié)果一致,無明顯“基質(zhì)效應”,該患者血清IgA的質(zhì)量濃度為8.84 g/dL,遠高于VB12試劑說明中抗IgA干擾上限1.6 g/dL,推測稀釋法檢測結(jié)果不成線性的主要原因是:低稀釋倍數(shù)時,高濃度的M蛋白會干擾VB12檢測。

VB12檢測采用競爭法的原理,使用VB12特異性內(nèi)因子,樣本中的VB12與加入的生物素標記的VB12競爭釕標記的內(nèi)因子復合物上的結(jié)合位點。有案例曾報道,IgGκ型M蛋白對VB12增強化學發(fā)光檢測法的干擾作用,高水平的M蛋白可與內(nèi)因子非特異性結(jié)合[9],M蛋白可占據(jù)內(nèi)因子上的結(jié)合位點,孵育時內(nèi)因子上能夠與生物素標記的VB12結(jié)合的空位減少,導致發(fā)光信號降低,使得檢測結(jié)果假性增高。

綜上所述,本案例中IgAκ型的M蛋白不僅干擾VB12的檢測吸樣,同時造成稀釋后的VB12檢測結(jié)果假性增高;低倍數(shù)的稀釋法難以消除M蛋白干擾,測定結(jié)果不可靠,隨著稀釋倍數(shù)增加,M蛋白的干擾作用會減弱。但稀釋法的效果取決于稀釋倍數(shù)和取樣準確性,也需要考慮稀釋介質(zhì)的基質(zhì)效應,不能一概否定此方法。因此,日常檢測工作中要重視M蛋白對免疫檢測的干擾作用,當檢測出現(xiàn)異常或結(jié)果與臨床征象不相符時,要與臨床醫(yī)生及時溝通,避免發(fā)出錯誤結(jié)果。