高通量測序技術在B族鏈球菌鑒別分型中的研究進展*

易樂暉,王飛玲 綜述,吳麗娟,3△ 審校

1.遵義醫科大學珠海校區,廣東珠海 519000;2.深圳市寶安區婦幼保健院檢驗科,廣東深圳 518106;3.深圳市寶安區婦幼保健院母胎醫學研究所,廣東深圳 518106

B族鏈球菌(GBS)是圍生期母嬰感染首位病原菌,可導致嚴重的新生兒侵襲性GBS感染[1]。孕產婦陰道和直腸的GBS定植率可達 15%～30%,約50% GBS定植孕產婦在分娩時會經產道傳播GBS給新生兒,1%～2%新生兒表現為侵襲性感染[2]。當前,新生兒GBS感染防控主要基于產婦陰道定植GBS菌株的篩查模式[3],對GBS定植母親分娩時使用抗菌藥物,可顯著減少新生兒侵襲性GBS感染的發生率[4];但也有研究者質疑普遍篩查的有效性和獲益[5],認為99.8%的GBS篩查陽性產婦及其新生兒被不必要地使用了抗菌藥物,探索更精準的預防篩查手段是臨床檢驗的重要方向[6-7]。近10年,國內外多個研究團隊利用高通量測序技術對GBS菌株進行毒力基因篩選、鑒別分型及分子進化等研究,并取得了積極進展。本文著重探索不同類型的高通量測序技術在GBS鑒別分型中的應用價值,以加深和拓寬對GBS致病機制和分子流行病學的認識,為圍生期GBS感染從菌株模式廣泛篩查到分子模式精準診斷奠定基礎。

1 高通量測序技術概述

基于二代測序(NGS)和三代測序的高通量測序技術,結合不同的應用需求,衍生出多種測序方法,本文涉及的多種測序技術的原理簡介及應用場景見表1。

2 高通量測序技術在GBS鑒別分型中的研究進展

2.1基于樣本的直接GBS鑒別和分型 16S核糖體RNA(16S rRNA)測序和宏基因組測序(mNGS)技術均在非培養方法檢出及鑒定GBS中有潛在的應用價值。妊娠期陰道微生態菌群相關研究發現,mNGS或16S rRNA測序可鑒別GBS,但尚未統計檢出率,也未進一步對GBS進行分型[12];有研究發現,16S rRNA測序相較于巢式PCR和定量PCR(qPCR)方法對胎盤中的GBS檢出率更高,研究認為與胎盤中GBS的菌量有關,當菌量較少時用16S rRNA檢測可能更靈敏,通過對另一組去除污染菌影響的胎盤樣本進行2次16S rRNA測序,在5%分娩前孕產婦的胎盤中鑒別出了GBS[13]。已有研究證實,mNGS可在腦脊液中檢出包括GBS在內的多種病原菌,對兒童細菌性腦膜炎具有早期診斷價值[14-15]。另外,在培養陰性的感染性心內膜炎患者血液樣本和心臟瓣膜樣本中,采用mNGS均鑒定出了GBS[16]。

2.2基于菌株的WGS與GBS分型 基于GBS全基因組信息,WGS既可分析傳統的分子流行病學信息,如血清型和基因型,也可進一步分析其克隆傳播特點并挖掘潛在未知信息。莢膜多糖(CPS)是GBS導致侵襲性疾病的重要毒力因素和疫苗靶標,據其不同可將GBS分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ 10種血清型[17],正處于臨床實驗階段的六價CPS結合疫苗可覆蓋Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅴ 6種主要莢膜血清型。美國各年齡段來源的6 340株和英國410株新生兒侵襲性菌株的WGS測序結果均顯示Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ/Ⅳ和Ⅴ這5～6種血清型占比超過98%[18-19],導致新生兒早發和晚發型疾病的Ⅲ型菌株分別占27.2%和69%,成人Ⅰa型菌株占比20.36%[18]。早期基因分型通常是基于7個管家基因的擴增和測序進行的多種序列分型(MLST)方法,按照等位基因的相似性將各種序列型(ST)進行克隆復合體(CC)歸類[18]。core genome MLST(cgMLST)是根據GBS核心基因組序列進行分型,比MLST分辨率更高[20]。全球198項關于GBS的研究中,有1/4的研究包含了MLST,但WGS相關研究不足5%[21],基于WGS可以完成MLST和cgMLST分型[18,22]。有研究已證實,相較于傳統檢測方法,WGS不僅能更準確對GBS血清型和基因型進行分型,還可以分析莢膜置換和不可分型的原因,并具有發現新的血清型或基因型及其相關突變的優勢[22]。根據GBS群體的WGS發現,單核苷酸多態性(SNP)差異不僅可以完成系統進化發育分析,也可用于比較GBS菌株之間的克隆傳播特點及關系,有研究認為,SNP差異為0的菌株遺傳上相同,SNP差異≤5的菌株遺傳上高度相似,可判斷為克隆傳播[19]。

2.3基于WGS分析GBS菌株的耐藥性 GORI等[23]通過WGS首次發現并證實四環素的廣泛使用可導致攜帶四環素耐藥基因整合元件(ICE)的CC17菌株在全球流行,新生兒GBS感染率升高,大環內酯類抗菌藥物的耐藥導致CC1型菌株增加。WGS還檢測到青霉素結合蛋白(PBP)2X突變菌株、攜帶萬古霉素耐藥基因vanY的CC23菌株和vanG的Ⅱ/ST22、Ⅴ/ST1 GBS菌株,使得GBS對β內酰胺酶類抗菌藥物和萬古霉素敏感性下降[18,24-25]。我國也有研究基于WGS獲取GBS全部耐藥信息并檢出多種多重耐藥簇[26-27]。

2.4WGS鑒別與篩選GBS侵襲性相關毒力基因 目前GBS確切致病的分子機制尚不明確,多數研究表明,GBS的高致病性與多種毒力基因有關,利用WGS檢測并鑒別與GBS侵襲致病相關的毒力基因,可進一步分析并預測基因功能。WGS檢測全球901株不同宿主的侵襲性GBS菌株,發現其可通過快速獲得或缺失基因適應新宿主或生態位環境,幾乎所有的菌株有一或多個遺傳移動元件(MGE)和致病菌毛島(PI),如PI-1、PI-2a和PI-2b[28]。WGS在美國最大樣本量的侵襲性GBS菌株中幾乎都檢測到與毒力相關的PI、α蛋白家族基因以及srr1和srr2基因[18]。利用泛基因組關聯研究分析1 988株侵襲和定植GBS菌株基因序列的多樣性,最終在279個致病特異基因聚集的5種不同功能的CC中檢測到與GBS代謝及人類患病相關基因多見于CC17(gcc1732、lepB、inLA_2、gcc1733)和CC23(mntH),其中參與GBS定植、GBS與其他微生物競爭特定生態位和代謝等多種途徑的基因存在差異,并發現CC17菌株的16個特異基因的等位變異在侵襲和定植菌株中顯著不同[24]。有研究進一步證實了CC17型定植和侵襲GBS菌株有14個基因突變存在SNP差異,確定侵襲菌株致病的關鍵且特異的基因srr2存在SNP差異,侵襲菌株通過交換染色體片段以適應不同宿主環境,在人類宿主中顯示出較強的傳播力,并在歐洲、北美、非洲及亞洲地區廣泛傳播[29]。

2.5RNA-seq鑒別GBS毒力基因 RNA-seq篩選GBS如何在轉錄組層面調節基因表達適應新的宿主環境和致病,常通過比較分析突變菌株和野生菌株的轉錄組或不同環境下的菌株轉錄組來實現。我國在魚類GBS中發現并鑒定了一種新型XRE家族轉錄調節因子(XtgS),動物實驗發現斑馬魚感染缺失XtgS 因子的菌株較野生型菌株死亡率低,可能其是GBS致病的負性調節因子,RNA-seq發現缺失XtgS的菌株有74和21個基因分別參與上調和下調,這些基因與噬菌體、膜蛋白、轉運蛋白、酶、代謝和轉運RNA(tRNA)生物合成等過程有關[30]。Cas9是規律成簇的間隔短回文重復序列及其相關蛋白(CRISPR/Cas)中的核酸內切酶之一,通過降解DNA對GBS毒力基因起調節作用,小鼠模型實驗顯示Cas9突變菌株較野生型菌株毒力弱,RNA測序發現參與代謝、毒力、細胞壁形成有關的基因以及雙組分調節系統(TCS)中的CiaR因子顯著失調,證實CiaR因子可促進GBS在陰道定植,對CiaR突變菌株RNA-seq顯示有25和33個基因分別參與上調和下調,這些基因包括了Cas9突變體中的上調和下調基因,說明Cas9可以通過其他因子調節GBS基因表達[31]。研究表明,高濃度鋅離子不利于野生Ⅲ/ST17型GBS菌株生存,對生存在不同濃度鋅離子環境的菌株進行RNA測序發現,包括czcD、nikABCD、mntH2和 mtsABC基因在內的229個基因和adcA基因在內的238個基因分別參與上調和下調,與GBS抵抗宿主來源蛋白的活性有關[32]。值得注意的是,RNA測序往往需要RT-qPCR來驗證測序結果的準確性。

2.6Tn-seq鑒別篩選GBS必需基因 Tn-seq可篩選GBS在某種特定生長環境中生存所需的基因,研究WGS中單個基因的適應度,以及基因之間的相互作用關系,還可識別潛在抗體靶標。HOOVEN等[33]首先建立并初步評估了一種基于GBS菌株A909的轉座子文庫,對其應用Tn-seq篩選出A909生存的必需基因占基因組比例為13.5%,關鍵基因占比為1.2%。目前該團隊還應用該文庫和Tn-seq對A909在血液和羊水中生存的必需基因進行篩選,并進一步完成對篩選出的個別必需基因進行基因敲除及RNA測序等功能驗證[34-35]。ZHU等[36-37]利用Tn-seq篩選Ⅴ型GBS菌株在全血和血漿中存活的重要基因aroA、metP和mtsA,其中aroA基因是必需基因,W903_1820是該GBS菌株在全血中生長的必需基因;另外,對GBS細胞壁肽聚糖生物合成起催化作用的青霉素結合蛋白(PBP)進行研究,構建野生型菌株和4種pbp(pbp1A、pbp1B、pbp2A、pbp2B)突變菌株文庫,經Tn-seq篩查5種菌株中共有350個必需基因,并發現某種pbp突變菌株需要其他pbp作為必需基因。Tn-seq在GBS基因組中的基因飽和度不夠高(39%～46%),近期有研究對肺炎鏈球菌進行CRISPR測序,體現出比Tn-seq更大的優勢,可檢測所有基因的適應度,但目前尚未將這一技術應用于GBS相關研究[33,38]。

3 小結與展望

對各種類型的人體樣本采用非培養方法直接16S rRNA測序或mNGS,數據處理時即可完善GBS鑒別及分型分析,可初步鑒別出臨床重要分型的GBS,更有望全面了解GBS的微生態分布特點?；贕BS菌株的WGS已篩選鑒別出較多的與致病性和流行傳播相關的毒力基因或分型靶標,可進一步應用于疫苗及診斷方法的設計。應用RNA-seq、Tn-seq篩查GBS可能的毒力調控基因及必需基因等可更全面了解其致病機制。高通量測序技術支撐和推動了GBS鑒別分型的精準分子診斷,我國目前仍較缺乏高通量測序技術在GBS的致病機制或分子流行病學中的應用研究數據,期待未來更快速、簡潔的高通量測序技術的發展及標準化、可視化的生物信息學分析的普及,為臨床防治GBS感染做出新貢獻,也對未來微生物檢驗的發展提供新思路。