尿流式細胞術在快速篩查及鑒別尿路感染病原菌中的應用*

錢景榮,張艷麗,郭愛萍,莊學偉

山東大學附屬山東省立第三醫(yī)院檢驗科,山東濟南 250031

尿路感染(UTI)是全球范圍內較為常見的感染性疾病,每年約有1.5億病例,其中多為女性和老年人[1]。雖然UTI的病死率約為2.3%,但如果合并菌血癥或感染性休克,病死率將升至26.0%[2]。目前,尿培養(yǎng)是確定和量化尿液中是否存在細菌的金標準,基于微生物學培養(yǎng),可明確菌株及抗菌藥物的靈敏度,以合理使用抗菌藥物。然而,尿培養(yǎng)結果通常需要24～48 h,大量標本中也會出現(xiàn)無細菌生長的情況,臨床醫(yī)生往往根據(jù)患者癥狀經(jīng)驗性使用抗菌藥物,疑似UTI患者使用的抗菌藥物約15%為處方類抗菌藥物,8%～65%患者治療無效[3],UTI已是經(jīng)驗性使用抗菌藥物第二大常見疾病,而抗菌藥物的大量使用也導致近年來抗菌藥物耐藥發(fā)生率和多重耐藥菌數(shù)量持續(xù)上升[4]。因此,預防、診斷、治療及監(jiān)測UTI十分重要。

有研究表明,尿培養(yǎng)與通過不同方法獲得的尿液分析結果之間可能存在關聯(lián)[5]。為預測陽性培養(yǎng)及排除陰性培養(yǎng),研究報道評估各種檢測技術:尿干化學分析(白細胞和亞硝酸鹽)、尿有形成分分析(顯微鏡或細胞計數(shù))以及包括患者信息和 UTI 風險因素在內的復雜算法。有研究表明,將 UF-5000尿有形成分分析儀檢測結果與尿液培養(yǎng)結果比較,尿流式細胞術篩查可在尿培養(yǎng)前檢測菌尿,具有良好的靈敏度,研究因組別大小、疑似UTI 診斷標準、菌尿定義及采用cut-off值而略有不同[6]。本研究旨在分析尿有形成分分析儀檢測結果與尿培養(yǎng)結果的差異,建立白細胞、細菌定量計數(shù)及細菌鑒別分類在UTI篩查方面的最佳cut-off值,特別是老年人群,以減少不必要的尿培養(yǎng)和抗菌藥物使用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年1-8月在本院就診或住院的1 221例疑似UTI患者;其中,男754例,女467例;年齡0～90歲,中位年齡59歲;合并泌尿系結石403例,合并前列腺增生79例,合并泌尿系腫瘤27例。本研究已排除臨床檢驗數(shù)據(jù)不全患者及導尿患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》概述中的倫理原則,倫理審查號為KYLL-2023017。

1.2儀器與試劑 UF-5000尿有形成分分析儀及配套試劑、質控品(日本希森美康Sysmex公司);全自動細菌鑒定及藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司);血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板(法國生物梅里埃公司)。

1.3方法

1.3.1尿液標本留取 所有患者留取清晨首次清潔的中段尿液2份,每份10 mL;囑男性患者在取樣前先清潔尿道口,女性患者取樣前先清洗外陰;將一份尿液收集至一次性尿液采集管,另一份尿液收集至一次性無菌螺旋蓋尿杯,1 h內送檢。

1.3.2尿有形成分分析結果 使用UF-5000尿有形成分分析儀分別對低值、高值質控物進行檢測,分析質控結果在控后,將尿液采集管標本放置標本架進行上機檢測,檢測指標包括尿白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞計數(shù)(RBC)、細菌計數(shù)(BACT)、上皮細胞計數(shù)、酵母菌計數(shù)及細菌分類信息[革蘭陽性菌(Gram Positive ?,GP)、革蘭陰性菌(Gram Negative ?,GN)、革蘭陽性/陰性菌(Gram Pos/Neg ?,GP/GN)和未分類(unclassified)]。若觸犯復檢規(guī)則,則需要進一步人工顯微鏡鏡檢復核。

1.3.3尿培養(yǎng) 充分混勻標本后,采用10 μL接種環(huán)取無菌尿杯標本,分別接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板,在37 ℃恒溫箱中進行培養(yǎng),24 h后觀察細菌生長情況并計數(shù)菌落。若出現(xiàn)細菌生長(革蘭陽性菌>104CFU/mL,革蘭陰性菌>105CFU/mL),則判定培養(yǎng)陽性,進一步選取優(yōu)勢菌進行分離純化、鑒定以及藥敏試驗等;若平板無出現(xiàn)細菌生長或細菌生長<104CFU/mL,則判定為無菌。此外,尿培養(yǎng)出3種以上的細菌且無優(yōu)勢菌生長考慮為污染,指導其重新留樣檢測。

1.4統(tǒng)計學處理 將UF-5000尿有形成分分析儀檢測數(shù)據(jù)與尿培養(yǎng)結果進行分析比較,以尿培養(yǎng)結果為金標準。采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計數(shù)資料以頻數(shù)或率表示,采用χ2檢驗;符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計量資料以均值(最小值,最大值)表示,非正態(tài)分布資料統(tǒng)計描述以中位數(shù)(最小值,最大值)表示,采用Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-WallisH檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線及曲線下面積(AUC)評估UF-5000尿有形成分分析儀的篩查及診斷性能,根據(jù)約登指數(shù)選取最佳cut-off值,獲得靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、真陽性率、假陽性率、假陰性率、真陰性率。采用Kappa值評估一致性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1尿培養(yǎng)結果 在納入1 221例患者中,386例患者尿培養(yǎng)陽性(31.6%),835例患者尿培養(yǎng)陰性(68.4%)。在386例患者尿培養(yǎng)陽性標本中,24例患者尿標本分離培養(yǎng)出2種細菌,48例患者尿標本分離出真菌。UTI病原菌中最常見細菌是革蘭陰性菌,占所有分離菌種的64.5%,主要為腸桿菌科。病原菌感染情況依次為:大腸埃希菌(123株),肺炎克雷伯菌(69株),屎腸球菌D群(33株),糞腸球菌D群(29株),銅綠假單胞菌(19株),奇異變形桿菌(15株),鮑曼不動桿菌(10株),革蘭陽性棒桿菌(8株),金黃色葡萄球菌(6株),表皮葡萄球菌(5株),摩氏摩根菌(5株),草綠色鏈球菌(4株),弗氏檸檬酸桿菌(2株),腐生葡萄球菌(1株),鶉雞腸球菌(1株),惡臭假單胞菌(1株),腔隙莫拉菌(1株),人葡萄球菌人亞種(1株),斯氏普羅威登斯菌(1株),雷氏普羅維登斯菌(1株),無乳鏈球菌(1株),陰溝腸桿菌復合菌(1株),黏質沙雷菌(1株)。其中,產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)菌共檢出79株,大腸埃希菌占43.9%,肺炎克雷伯菌占36.2%。真菌感染占所有分離菌種的12.4%,分別為白假絲酵母菌(21株),熱帶假絲酵母菌(13株),近平滑白假絲酵母菌(9株),光滑假絲酵母菌(4株),季也蒙假絲酵母(1株)。

2.2細菌種類和BACT 與感染大腸桿菌UTI患者BACT、WBC和RBC比較,感染肺炎克雷伯菌UTI患者的WBC和RBC升高(P=0.008、0.026),感染鮑曼不動桿菌UTI患者的BACT降低(P=0.005),感染腸球菌屬UTI患者的WBC降低(P=0.003),而RBC略有升高(P<0.001)。此外,感染葡萄球菌屬和(或)假絲酵母菌屬UTI患者的RBC均顯著升高(P=0.006、0.008),BACT顯著降低(P=0.005、<0.001),特別是假絲酵母菌。UF-5000尿有形成分分析結果見表1。

表1 UF-5000尿有形成分分析結果

2.3明確UTI診斷的cut-off值 以尿培養(yǎng)陽性為診斷標準,繪制BACT 和WBC診斷UTI的ROC曲線,BACT診斷UTI的AUC為0.888(95%CI:0.865～0.912,P<0.001),大于WBC的AUC(0.788,95%CI:0.759～0.818,P<0.001),見圖1。根據(jù)約登指數(shù),BACT的最佳cut-off值為972.8 /μL,其靈敏度為73.1%,特異度為92.0%;WBC的最佳cut-off值為86.1 /μL,其靈敏度為73.7%,特異度為73.6%;聯(lián)合采用BACT>972.8 /μL且WBC>86.1 /μL時,靈敏度為60.1%,特異度高達95.9%。結果表明,在明確UTI診斷方面,BACT優(yōu)于WBC,二者聯(lián)合檢測有助于提高特異度。

考慮本研究人群中位年齡大及性別差異等因素,從中選取60歲以上的老年人共617例,其中男359例(58.2%),女性258例(41.8%),對該人群BACT、WBC對UTI的診斷價值分別進行ROC曲線分析。研究發(fā)現(xiàn),老年男性BACT診斷UTI的AUC為0.901(95%CI:0.859～0.942,P<0.001),WBC診斷UTI的AUC為0.806(95%CI:0.754～0.858,P<0.001)。根據(jù)約登指數(shù),BACT最佳cut-off值和WBC分別為1 091.65 /μL和98.3 /μL;女性BACT診斷UTI的AUC為0.923(95%CI:0.888～0.958,P<0.001),大于WBC診斷UTI的AUC為0.743,95%CI:0.683～0.804,P<0.001),BACT的最佳cut-off值為475.15 /μL,WBC的最佳cut-off值為85.95 /μL。結果表明,在診斷UTI方面,對于BACT,老年女性優(yōu)于老年男性,對于WBC,老年男性優(yōu)于老年女性,老年男性最佳cut-off值略高于老年女性。見圖2。

圖1 BACT、WBC與尿培養(yǎng)結果的ROC曲線

注:A為老年男性;B為老年女性。

2.4明確尿培養(yǎng)陰性的cut-off值 在篩查試驗中,靈敏度是最重要的衡量指標,為減少不必要的尿培養(yǎng),應選取較高靈敏度評估BACT的最佳cut-off值。當采用靈敏度分別為98.5%、95.3%、90.0%時,BACT的cut-off值為15.65、60.85、170.30 /μL,同時根據(jù)假陰性個數(shù)較小、陰性預測值較大、綜合特異度的原則,最佳BACT cut-off值為60.85 /μL,與BACT的cut-off值(15.65 /μL)相比,具有相對較高的陰性預測值(94.2%)。見表2。

在60歲以上的老年人群中,男性BACT的最佳cut-off值為156.40 /μL,靈敏度93.3%,陰性預測值最高為95.2%,女性BACT的最佳cut-off值為134.70 /μL,靈敏度95.9%,陰性預測值95.1%,與BACT cut-off值(87.25 /μL)相比,假陰性例數(shù)僅增加3例,真陰性例數(shù)增加到77例。見表3、4。

表2 不同BACT cut-off值的篩查分析

表3 老年男性的不同BACT cut-off值的篩查分析

表4 老年女性的不同BACT cut-off值的篩查分析

WBC也是UTI篩查的重要因素。將BACT的最佳cut-off值與不同WBC的cut-off值結合,計算靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、真陽性、真陰性、假陽性及假陰性。采用靈敏度和陰性預測值最大、假陰性個數(shù)最小及整合特異度等原則,得出WBC的最佳cut-off值。研究發(fā)現(xiàn),當滿足BACT<60.85 /μL或WBC<15.00 /μL時,靈敏度最高(為89.3%),陰性預測值最高(為92.2%)。在老年男性人群中,發(fā)現(xiàn)當滿足BACT<156.40 /μL或WBC<15.00 /μL時,靈敏度最高(為88.6%),陰性預測值最高(為93.4%),與尿培養(yǎng)一致率(為73.0%),可減少47.1%不必要的尿培養(yǎng);在老年女性人群中,發(fā)現(xiàn)當滿足BACT<134.70 /μL或WBC<15 /μL時,靈敏度最高(為90.8%),陰性預測值高達91.3%,與尿培養(yǎng)一致率(為71.3%)。見表5。

表5 BACT最佳cut-off值結合不同WBC cut-off值性能分析

2.5判讀革蘭陽性/陰性菌 在184例尿培養(yǎng)陽性標本中,51例細菌分類信息標記為GP,81例標記為GN,47例標記為GP/GN,5例標記為unclassified。在47例標記為GP/GN中,22例培養(yǎng)為革蘭陽性/陰性菌,22例培養(yǎng)為革蘭陰性菌,3例培養(yǎng)為革蘭陽性菌。使用UF-5000尿有形成分分析儀正確識別140例(76.1%),與尿培養(yǎng)結果的一致性Cohen′s Kappa值為0.764(χ2=81.625,P<0.001)。見表6。

表6 細菌分類信息評估

3 討 論

快速篩查病原菌為革蘭陽性/陰性菌能更迅速地幫助臨床醫(yī)生對患者給予恰當處理及治療,并減少不必要的尿培養(yǎng)。對本研究納入1 173例疑似UTI患者分析發(fā)現(xiàn),BACT診斷效能高于WBC,這與之前研究報道一致[7]。HAUGUM等[8]單獨或組合WBC 和 BACT并考慮了性別差異,2個參數(shù)的 cut-off值均調整為30 /mL,菌尿定義為104CFU/mL,其靈敏度為96.6%,特異度為55.5%,陰性預測值為92.3%,陽性預測值為74.7%,略低于SEMULIK等[9]研究結果(WBC≥40 /μL或BACT≥300 /μL,靈敏度為100.0%,特異度為83.7%,陰性預測值為100.0%及陽性預測值為75.0%[9],與本研究結果相似,采用BACT<60.85 /μL或WBC<15 /μL時,靈敏度為89.3%,特異度51.1%,陰性預測值為92.2%。HAUGUM等[8]還發(fā)現(xiàn),聯(lián)合檢測的陰性預測值低于WBC或BACT單獨檢測(分別為69.9%和91.2%)。GARCIA-COCA等[10]建議調整使用“或”而不是“和”選擇 cut-off值。KIM等[11]研究報道,僅采用BACT cut-off值為15 /μL時,具有更高的篩選率(50.9%)和陰性預測值(99.5%)。此外,對免疫功能低下患者亞組(399例)分析發(fā)現(xiàn),BACT≥267 /μL,靈敏度為90%和特異度為93%,而BACT≥ 27 /μL時,靈敏度為99%,特異度為77%[10]。針對UF-5000在篩查陰性尿培養(yǎng)性能的研究表明,由于研究納入的患者人群和對菌尿的分類及定義不同,不同實驗室應用cut-off值略有差別。

通常老年人群具有較高的UTI的患病率,據(jù)報道15%～50%就診的老年人發(fā)生無癥狀菌尿[12],尿培養(yǎng)的適應證更為寬泛。ALENKAER 等[13]研究顯示,針對就診于急診科的老年人(544例),分別采取BACT≥10×106/L或YLC≥25×106/L;BACT≥20×106/L或YLC ≥ 25×106/L;BACT ≥ 50×106/L或YLC ≥ 25×106/L時,靈敏度分別為95%、98%、100%,陰性預測值分別為87%、97%、100%。考慮到性別因素,本研究發(fā)現(xiàn),在老年男性人群的cut-off值(BACT<156.4 /μL或WBC<15 /μL)要高于老年女性人群(BACT<134.7 /μL或WBC<15 /μL)。由于老年人自我保健能力下降、衛(wèi)生條件差、糞便污染和認知障礙,這類人群尿培養(yǎng)經(jīng)常發(fā)生污染。IPPOLITI等[14]基于WBC、鱗狀細胞(與受污染的標本有關)和電導率(與尿液濃度相關的研究參數(shù))等參數(shù),采用鱗狀細胞>30 /mL或電導率<6 mS/cm或WBC<5 /mL預測陰性培養(yǎng),其靈敏度達100%,特異度為94%,陽性預測值為72%,陰性預測值達100%。在老年人群中,結合酵母菌計數(shù)、鱗狀細胞及電導率似乎更有助于排除污染的干擾,提高陰性預測。

此前,UF-1000i 將細菌分類為“棒狀”或“球菌/混合”,而不是革蘭陽性/陰性菌,細菌分類性能不令人滿意且不滿足臨床使用[15],UF-5000的改進提高了革蘭陽性/陰性菌的分類性能。REN等[16]報道,UF-5000的BACT信息可正確識別67.7%標本,與尿培養(yǎng)一致性為0.775。本研究中,UF-5000的BACT信息可正確識別76.1%,一致性為0.764。KIM等[11]研究表明,在細菌生長為105CFU/mL 的UTI中,使用GN標記(包括GP/GN標記),革蘭陰性菌的靈敏度和特異度約為90%,陽性預測值較高(為95.4%);使用GP標記(包括GP/GN標記),革蘭陽性菌的靈敏度和特異度比例略低(均約為80%),這些結果可能反映所包含細菌的特征差異。KIM等[11]研究通過對患者進一步隨訪發(fā)現(xiàn),UF-5000和細菌培養(yǎng)之間的BACT變化和細菌分類結果大致匹配,表明UF-5000 提供的快速和定量的參數(shù)信息更有助于患者隨訪、檢測細菌種類及監(jiān)測BACT的變化。

總之,UF-5000在篩查尿培養(yǎng)陽性、陰性標本及革蘭陰陽性菌鑒定方面表現(xiàn)出較好的性能,特別是針對老年人群,因其UTI情況復雜,采用UF-5000可優(yōu)化cut-off值,有利于規(guī)范抗菌藥物使用,以及減少不必要的尿培養(yǎng)。目前,仍需擴大研究人群優(yōu)化cut-off值,開發(fā)將快速篩查儀器應用于診斷和治療決策過程的算法或與其他檢測方式(如質譜和分子生物學方法)相結合,以更有效地應用于臨床實踐。