Circ-CDYL通過(guò)miR-223-3p/PHF19軸調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤對(duì)硼替佐米的敏感性*

周 燕,唐云龍△,劉佳琦,吳蕾蕾,孫乃同

1.南京醫(yī)科大學(xué)鹽城臨床醫(yī)學(xué)院/鹽城市第三人民醫(yī)院血液內(nèi)科,江蘇鹽城 224000;2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇南通 226000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是臨床上常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。硼替佐米(BTZ)是一種蛋白酶體抑制劑,作為常用的化療藥物之一,BTZ可以改善MM的預(yù)后和治療,但由于機(jī)體內(nèi)在和獲得性化學(xué)抗性,其治療效果受到很大影響[2-3]。因此,研究BTZ的耐藥機(jī)制對(duì)耐藥MM患者的治療具有積極意義。環(huán)狀RNA(CircRNA)是一類特殊的RNA分子,在人類癌癥(包括MM)的發(fā)生和化學(xué)抗性中的重要作用,其通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,從而影響化療效果[4]。研究顯示,Circ-CDYL是一種新發(fā)現(xiàn)的CircRNA,已被證實(shí)在MM組織和血漿標(biāo)本中呈高表達(dá),對(duì)MM具有良好的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值[5]。然而,目前尚不清楚Circ-CDYL是否與MM的耐藥機(jī)制調(diào)節(jié)有關(guān)。研究顯示,miR-223-3p在MM腫瘤細(xì)胞系中處于低表達(dá)狀態(tài),其參與MM細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控,并且與BTZ的敏感性相關(guān)[6-7]。此外,生物學(xué)信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miR-223-3p很可能與CircRNA存在相互作用。有研究表明,PHD鋅指蛋白19(PHF19)是miR-223-3p的下游靶基因之一,敲低PHF19可在體外和體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng),其有望成為MM新型治療靶點(diǎn)[8]?；诖?本研究主要探索Circ-CDYL的功能和Circ-CDYL/miR-223-3p/PHF19內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA網(wǎng)絡(luò)在BTZ耐藥中的調(diào)控作用,從而了解MM的耐藥機(jī)制,為耐藥MM患者新療法的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1血清標(biāo)本收集 收集2018年10月至2021年10月于鹽城市第三人民醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱本院)接受治療的118例MM患者的血清標(biāo)本。將未接受任何治療的60例患者作為BTZ敏感組,接受BTZ治療產(chǎn)生化療耐藥性的58例MM患者作為BTZ耐藥組。排除接受其他類型治療的MM患者。所有患者均簽署知情同意書,本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021023)。

1.2細(xì)胞、主要試劑與儀器 親本MM細(xì)胞系MM1.S細(xì)胞(貨號(hào):C1713)和耐BTZ細(xì)胞系MM1.R細(xì)胞(貨號(hào):C1811)均購(gòu)自上海WHELAB。RPMI-1640購(gòu)自武漢Procell(貨號(hào):PM150110);BTZ購(gòu)自上海源葉(貨號(hào)B34605),高效液相色譜法(HPLC)≥98%;LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen(貨號(hào):L3000015)。Beyozol總RNA抽提試劑購(gòu)自上海Beyotime(貨號(hào):R0011);QuantiTect Reverse Transcription試劑盒(貨號(hào):DXT-205314)、QuantiTect SYBR?Green PCR Kit(貨號(hào):204145)購(gòu)自美國(guó)Qiagen;CCK-8試劑盒(貨號(hào):CK04)和Annexin V-FITC/PI試劑盒(貨號(hào):AD10-2)均購(gòu)自日本同仁化學(xué);LucPairTMDuo-Luciferase HS Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia(貨號(hào):LF005);PHF19、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Ki67、剪切化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(C-caspase 3)、GAPDH一抗及二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology。構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系所用Circ-CDYL短發(fā)夾RNA(shRNA)的慢病毒載體(sh-Circ-CDYL)和含有陰性對(duì)照shRNA的慢病毒載體(sh-Circ-NC),以及miR-223-3p抑制劑(anti-miR-223-3p)、miR-223-3p模擬物(miR-223-3p mimics)、陰性對(duì)照(miR-NC)均購(gòu)自GenePharma;pcDNA-PHF19重組慢病毒載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將MM1.S和MM1.R細(xì)胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,100 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素),于飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)。MM1.R細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前使用10 nmol/L BTZ處理24 h。根據(jù)轉(zhuǎn)染情況將MM1.R細(xì)胞分為C組、sh-Circ-C組、sh-Circ-CDYL組、sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p組和sh-Circ-CDYL+pcDNA-PHF19組。其中,C組未轉(zhuǎn)染,sh-Circ-C組轉(zhuǎn)染sh-Circ-NC慢病毒載體,sh-Circ-CDYL組轉(zhuǎn)染sh-Circ-CDYL慢病毒載體,sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p組轉(zhuǎn)染sh-Circ-CDYL慢病毒載體及anti-miR-223-3p慢病毒載體,sh-Circ-CDYL+pcDNA-PHF19組轉(zhuǎn)染sh-Circ-CDYL慢病毒載體及pcDNA-PHF19重組慢病毒載體。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)研究,使用熒光定量PCR(RT-qPCR)和免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2RT-qPCR檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求提取總RNA,并進(jìn)行純化,然后通過(guò)QuantiTect Reverse Transcription試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,使用QuantiTect SYBR?Green PCR試劑盒通過(guò)特異性引物和cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列見表1。反應(yīng)條件:90 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性15 s,65 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,連續(xù)循環(huán)40次。然后,通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算。

表1 引物序列

1.3.3蛋白質(zhì)檢測(cè) 5組細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,加入細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白,將待測(cè)蛋白上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE,10%)電泳,電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,以5%脫脂牛奶封閉,取膜,清洗,加入PHF19、PCNA、Ki67、C-caspase 3一抗(稀釋倍數(shù)1∶400)4 ℃孵育過(guò)夜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后,TBST洗滌3次,最后滴加ECL發(fā)光液曝光顯影,檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J軟件分析各條帶灰度值,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4細(xì)胞活力測(cè)定 采用不同濃度的BTZ(0、1、5、10、20、40、80、160 nmol/L)對(duì)5組細(xì)胞處理24 h,添加10 mL的CCK-8試劑處理120 min,于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)上清吸光度(A)值。當(dāng)細(xì)胞活力降低為50%時(shí)的BTZ濃度即為BTZ的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 將不同處理的MM1.R細(xì)胞以500個(gè)/孔的密度接種于六孔板,飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)2周。使用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.6細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用Annexin V-FITC染色觀察細(xì)胞凋亡情況。收集5組細(xì)胞,PBS洗滌3次,采用1×Binding buffer將待測(cè)細(xì)胞制成1×106/mL的細(xì)胞懸液,接著加入Annexin V-FITC,避光、室溫孵育10 min,加入PI染色液(10 μL)進(jìn)行染色,大約15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站StarBase(https://starbase.sysu.edu.cn)和TargetScan(https://www.targetscan.org/vert_80/)預(yù)測(cè)miR-223-3p、circ-CDYL或PHF19的結(jié)合。按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說(shuō)明書將anti-miR-223-3p野生型(WT)或突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體單獨(dú)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,或同時(shí)添加circ-CDYL、PHF 19 mimic轉(zhuǎn)入MM1.R細(xì)胞,獲得circ-CDYL-野生型/突變型(WT/MUT)細(xì)胞及PHF 19-WT/MUT細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后移去培養(yǎng)液。采用PBS洗滌細(xì)胞,棄去洗滌液后,每孔中加入1×細(xì)胞裂解液,振蕩10 min,3 000 r/min離心5 min,按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1Circ-CDYL、miR-223-3p和PHF19在不同血清標(biāo)本和細(xì)胞中的表達(dá)情況 與BTZ敏感組比較,BTZ耐藥組Circ-CDYL和PHF19 mRNA表達(dá)明顯升高,miR-223-3p表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。與MM1.S細(xì)胞比較,MM1.R細(xì)胞Circ-CDYL和PHF19 mRNA表達(dá)明顯升高,miR-223-3p表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表2 Circ-CDYL、miR-223-3p和PHF19 mRNA在不同血清標(biāo)本中的表達(dá)

表3 Circ-CDYL、miR-223-3p和PHF19 mRNA在不同細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2各組MM1.R細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 與轉(zhuǎn)染sh-Circ-C的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染sh-Circ-CDYL的MM1.R細(xì)胞Circ-CDYL和PHF19 mRNA表達(dá)水平明顯降低,miR-223-3p表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與sh-Circ-CDYL組比較,sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p組、sh-Circ-CDYL+pcDNA-PHF19組PHF19 mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05),sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p組miR-223-3p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見表4。

表4 各組MM1.R細(xì)胞Circ-CDYL、miR-223-3p和PHF19表達(dá)

2.3MM1.R細(xì)胞的增殖、凋亡及蛋白表達(dá)情況 與sh-Circ-NC組比較,sh-Circ-CDYL組中MM1.R細(xì)胞對(duì)BTZ的IC50、集落形成數(shù)量均明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞凋亡蛋白PCNA、Ki67的蛋白表達(dá)水平均下調(diào),C-caspase 3蛋白表達(dá)水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與sh-Circ-CDYL組比較,sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p組或sh-Circ-CDYL+pcDNA-PHF19組中MM1.R細(xì)胞對(duì)BTZ的IC50、集落形成數(shù)量均明顯增加,細(xì)胞凋亡率降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);細(xì)胞PCNA、Ki67蛋白水平均上調(diào),C-caspase 3蛋白水平下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、2和表5。結(jié)果表明敲低Circ-CDYL可提高M(jìn)M1.R細(xì)胞對(duì)BTZ的敏感性。

圖1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組MM1.R細(xì)胞增殖情況

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組MM1.R細(xì)胞凋亡

表5 各組MM1.R細(xì)胞IC50、細(xì)胞增殖和凋亡能力檢測(cè)

續(xù)表5 各組MM1.R細(xì)胞IC50、細(xì)胞增殖和凋亡能力檢測(cè)

注:A-E依次代表NC組、sh-Circ-NC組、sh-Circ-CDYL組、sh-Circ-CDYL+anti-miR-223-3p組和sh-Circ-CDYL+pcDNA-PHF19組。

2.4miR-223-3p與Circ-CDYL或PHF19相互作用分析 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示:在Circ-CDYL或PHF19中存在miR-223-3p的互補(bǔ)作用位點(diǎn)(圖4)。MM1.R細(xì)胞的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,相對(duì)于miR-NC的轉(zhuǎn)染,miR-223-3p mimics轉(zhuǎn)染明顯抑制Circ-CDYL-WT或PHF19-WT質(zhì)粒中的熒光素酶活性(P<0.05),但對(duì)Circ-CDYL-MUT或PHF19-MUT質(zhì)粒中的熒光素酶活性變化無(wú)影響(P>0.05),見表6。結(jié)果表明miR-223-3p可抑制Circ-CDYL、PHF19的表達(dá)。

圖4 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-223-3p可與Circ-CDYL或PHF19結(jié)合

表6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

3 討 論

腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性是導(dǎo)致MM預(yù)后差的重要因素[10]。BTZ是MM的一線化療藥物,BTZ耐藥是導(dǎo)致MM化療失敗的常見原因[11]。因此,尋找新的靶點(diǎn)和了解BTZ耐藥的分子機(jī)制對(duì)于MM的治療極為重要。

CircRNA因其閉環(huán)結(jié)構(gòu)而具有RNA酶消化抗性,在真核細(xì)胞中呈高表達(dá),具有良好的穩(wěn)定性,可作為癌癥生物標(biāo)志物[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),多種CircRNA可作為MM耐藥性的調(diào)節(jié)因子,例如,circPSAP可調(diào)控海綿調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?的表達(dá),進(jìn)而影響MM細(xì)胞增殖、凋亡和BTZ敏感性[7]。

Circ-CDYL又稱circ0075517,在腫瘤發(fā)生和惡性發(fā)展中具有多種功能。研究顯示,Circ-CDYL在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào),與肝癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)[12-13]。Circ-CDYL已被證明可通過(guò)抑制miR-1180,削弱其對(duì)yes相關(guān)蛋白的抑制,最終導(dǎo)致MM不受控制[5]。然而,關(guān)于Circ-CDYL與MM耐藥的相關(guān)性尚鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí),Circ-CDYL在耐BTZ MM患者血清和MM1.R細(xì)胞(耐BTZ細(xì)胞系)中高表達(dá),提示Circ-CDYL的高表達(dá)可能與MM對(duì)BTZ的敏感性有關(guān),進(jìn)一步研究顯示,敲低Circ-CDYL可明顯下調(diào)MM1.R細(xì)胞對(duì)BTZ的IC50,同時(shí)抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明,敲低Circ-CDYL可顯著提高M(jìn)M1.R細(xì)胞對(duì)BTZ的敏感性。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)了miR-223-3p在Circ-CDYL序列中的結(jié)合位點(diǎn),并驗(yàn)證了Circ-CDYL與miR-223-3p之間的分子結(jié)合。此外,本研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-223-3p可部分逆轉(zhuǎn)敲低Circ-CDYL的MM1.R細(xì)胞對(duì)BTZ敏感性(P<0.05)。CircRNA可作為miRNA的海綿參與調(diào)節(jié)各種生物行為,例如,circ-ATP10A作為miR-6758-3p、miR-3977等多個(gè)miRNA的海綿,調(diào)控其下游mRNA,進(jìn)而促進(jìn)MM的血管生成[4]。此外,circRNA-102231通過(guò)靶向結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞miR-145,上調(diào)ABCB1,進(jìn)而降低順鉑敏感性[14]。以上研究提示,Circ-CDYL可能作為miR-223-3p的海綿,進(jìn)而調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的BTZ抗性。PHF19已被證明是miR-223-3p的下游靶標(biāo),據(jù)報(bào)道,PHF19是一種表觀遺傳調(diào)控因子,PHF19過(guò)表達(dá)與晚期和侵襲性MM疾病階段顯著相關(guān)[15]。PHF19過(guò)表達(dá)與MM患者較差的生存率顯著相關(guān)[8]。本研究結(jié)果表明,PHF19在耐BTZ MM患者血清和MM1.R細(xì)胞中呈高表達(dá),Circ-CDYL可通過(guò)海綿化miR-152-3p來(lái)調(diào)控PHF19的表達(dá)水平,并且PHF19過(guò)表達(dá)可部分抵消Circ-CDYL敲低引起的MM1.R細(xì)胞BTZ敏感性降低趨勢(shì)。多種CircRNA/miRNA/mRNA軸均參與了MM的BTZ抗性調(diào)控,如CircRERE通過(guò)海綿吸收miR-152-3p以調(diào)節(jié)CD47的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)癌變和激發(fā)BTZ抗性[16]。因此,推測(cè)miR-223-3p/PHF19軸可能是Circ-CDYL調(diào)節(jié)MM的BTZ敏感性的原因之一。

本研究結(jié)果顯示,Circ-CDYL通過(guò)靶向miR-223-3p/PHF19軸進(jìn)而調(diào)節(jié)MM的BTZ敏感性,提示下調(diào)Circ-CDYL可能是克服MM患者BTZ耐藥的治療策略。但本研究結(jié)果為臨床及體外細(xì)胞水平的探索,隨后將構(gòu)建Circ-CDYL敲除動(dòng)物模型,探索Circ-CDYL在體內(nèi)是否具有同等的作用機(jī)制,以便進(jìn)一步明確Circ-CDYL在MM化療耐藥中的作用機(jī)制。