過敏性紫癜患兒增殖誘導配體的表達及相關機制初探*

曾艷云,龔 霞,周 延

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院大足醫(yī)院/重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院兒童中心,重慶 402360

過敏性紫癜(HSP)是一種以免疫球蛋白A1(IgA1)型免疫復合物沉積為主的系統(tǒng)性小血管炎[1],其典型的臨床三聯(lián)征包括紫癜、關節(jié)痛/關節(jié)炎和胃腸道受累,此外腎臟表現(xiàn)在受累患者中也十分常見[2]。目前研究認為半乳糖缺陷型IgA1(Gd-IgA1)在HSP發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[3]。然而,HSP導致血管壁損傷的機制尚不清楚。一項大型IgA全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了一個包含TNFSF13基因的位點,該基因與B細胞激活因子(BAFF)具有高度同源性(48%),被認為是與IgA相關的易感基因,編碼增殖誘導配體(APRIL)[4]。APRIL是腫瘤壞死因子超家族(TNF)成員[5],除了影響人類B細胞的存活和增殖外,也可以與B細胞成熟抗原(BCMA)結合,促使人類B細胞誘導Ig重鏈亞類轉化為IgA[6-7]。在APRIL缺陷小鼠中,觀察到IgA選擇性缺陷[8],這表明APRIL在IgA產生過程中發(fā)揮重要作用。為了探索APRIL在HSP中的潛在機制,本研究檢測了不同臨床表現(xiàn)的HSP患者血漿APRIL、Gd-IgA1水平及外周血B細胞BCMA mRNA表達差異,并進一步評估了其對IgA1分子糖基化和BCMA mRNA表達的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1-10月在本院初次診斷為HSP的51例門診和住院患兒作為HSP組,年齡2～14歲,男27例,女24例,病程2～60 d。納入標準:(1)依據(jù)2012年中華中醫(yī)藥學會HSP診斷標準[9];(2)處于疾病活動期;(2)血小板計數(shù)和凝血功能正常,未合并其他過敏性疾病、感染、自身免疫性疾病或其他嚴重的全身性疾病;(3)未服用糖皮質激素、抗氧化劑、免疫抑制劑或其他藥物。51例HSP患兒按HSP疾病嚴重程度評價標準[10-11]進行評分。根據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室檢查將患兒分為4個亞組:(1)皮膚型亞組(20例):典型的皮膚紫癜,無腹痛、關節(jié)痛、腎臟受累,常規(guī)尿檢及24 h尿蛋白定量未見異常;(2)關節(jié)型亞組(8例):典型的皮膚紫癜伴關節(jié)腫脹疼痛;(3)腹型亞組(12例):典型的皮膚紫癜伴腹痛,糞便隱血試驗陽性;(4)腎型亞組(11例):典型的皮膚紫癜伴不同程度的腎損害,尿蛋白尿和(或)血尿陽性。同時,招募年齡和性別與HSP患兒匹配的健康體檢兒童作為對照組,年齡2～14歲,男27例,女30例。本研究已獲得本院倫理委員會批準,以及所有患兒及家屬的知情同意。

1.2儀器與試劑 ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自ABI公司(美國),Multiskan FC全自動酶標檢測儀購自Thermo Fisher公司(美國)。人外周血淋巴細胞分離液Ficoll Paque plus購自GE公司(美國),CD19+磁珠購自Becton Dickinson(美國),Trizol試劑購自Invitrogen(美國),First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Scientific(美國),TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術股份有限公司(中國),人血漿Gd-IgA1 ELISA檢測試劑盒和人APRIL酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自北京東革生物科技有限公司(中國),人重組APRIL蛋白購自Peprotech公司(美國)。

1.3方法

1.3.1標本采集 于HSP組就診時及對照組體檢時,采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝真空采集管采集患兒血液標本約5 mL。離心取血漿,分成三等份,置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2外周血B細胞中BCMA mRNA表達檢測 使用Ficoll Paque plus通過密度梯度離心制備外周血單個核細胞(PBMC),以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,再懸浮于含1%牛血清清蛋白(BSA)的PBS中。用CD19+磁珠分選B細胞。根據(jù)Trizol使用說明書提取總RNA。采用Nano Drop 2000c分光光度計的說明測量總RNA純度和濃度。按照First Strand cDNA Synthesis Kit說明書,取1 μg總RNA逆轉錄為cDNA,總反應體積為12 μL。引物序列:GAPDH正向引物為5′-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3′,反向引物為5′-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3′;BCMA正向引物為5′-TTTGAAGGGTGTGATGCTTG-3′,反向引物為5′-ATGCGCTCATCCTCTGAAAT-3′。PCR反應體積為20 μL,反應條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s,共45個循環(huán)。BCMA mRNA的相對表達量通過2-ΔΔCt計算。

1.3.3血漿APRIL和Gd-IgA1水平測定 根據(jù)ELISA測試試劑盒的說明步驟檢測血漿APRIL水平和Gd-IgA1水平。血漿標本采用酶免疫試驗緩沖液按1∶50的比例稀釋,培養(yǎng)60 min;然后,用標記抗體的洗滌緩沖液洗滌4次,孵育30 min,清洗平板并添加50 μL 三甲基鋁(TMA)溶液,避光培養(yǎng)30 min。最后,停止顯色反應,并測量450 nm及625 nm處的吸光度。

1.3.4B淋巴細胞體外培養(yǎng)及處理 為檢測外源性APRIL對體外試驗中Gd-IgA1和BCMA mRNA表達的影響,采用貼壁法從HSP組和對照組的PBMC中去除單核細胞,剩余大部分細胞為淋巴細胞。在補充有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)。將B淋巴細胞以3×105/孔密度接種到96孔板中,并與25 ng/mL外源性APRIL[12]孵育48 h。800 r/min離心10 min后,收集上清液用于檢測Gd-IgA1水平。此外,用CD19+磁珠分選B細胞,用熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測其BCMA mRNA相對表達量。

2 結 果

2.1HSP組及HSP各亞組與對照組血漿APRIL水平比較 HSP組、皮膚型亞組、關節(jié)型亞組、腹型亞組患兒血漿APRIL水平分別為0.676(0.608)ng/mL、0.379(0.290)ng/mL、0.686(0.677)ng/mL、0.657(0.342)ng/mL、1.218(1.395)ng/mL,與對照組的0.139(0.251)ng/mL相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,腎型亞組血漿APRIL水平高于皮膚型亞組、關節(jié)型亞組和腹型亞組(P<0.05),皮膚型亞組血漿APRIL水平低于其他3個亞組(P<0.05),而關節(jié)型亞組與腹型亞組APRIL水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2相關性分析 Spearman相關分析顯示,HSP患兒血漿APRIL水平與Gd-IgA1呈正相關(r=0.876,P<0.001),與BCMA mRNA表達呈正相關(r=0.678,P<0.001),與HSP嚴重程度評分呈正相關(r=0.796,P<0.001)。見圖1。

注:A為血漿APRIL水平與Gd-IgA1水平;B為血漿APRIL水平與BCMA mRNA;C為血漿APRIL水平與疾病嚴重程度評分。

2.3外源性APRIL對體外試驗中Gd-IgA1和BCMA mRNA表達的影響 經(jīng)外源性APRIL處理后,從HSP患兒分離的淋巴細胞上清液Gd-IgA1水平明顯高于對照組[(0.127±0.018)U/mLvs.(0.045±0.003)U/mL,P=0.014)],BCMA mRNA水平也明顯上調(1.765±0.223vs.1.206±0.081,P=0.014)。

3 討 論

作為HSP血管壁中的主要沉積物[1],IgA分子在HSP的發(fā)病機制研究方面引起了極大關注。APRIL是一種刺激B細胞增殖和IgA產生的細胞因子[6]。研究顯示,小鼠抗APRIL單克隆抗體可抑制ddY小鼠血清IgA水平,降低循環(huán)免疫復合物的腎臟沉積,并抑制蛋白尿發(fā)生[12]。本研究結果顯示,HSP組患兒血漿APRIL水平增加,并且各亞組患兒,APRIL水平升高最明顯,且與B細胞中其受體BCMA mRNA表達增加呈正相關,從而誘導異常糖基化IgA1分子產生增加,最終導致HSP發(fā)病和進展。

HSP是一種影響小血管的系統(tǒng)性血管炎[1]。在這種情況下,患者易出現(xiàn)血管周圍炎性細胞浸潤[2]。有報道稱,HSP患者發(fā)生腎小球損傷的原因可能是含有Gd-IgA1的系膜免疫復合物的沉積[13],隨后,補體介導的系膜細胞刺激發(fā)生,導致其增殖;同時也會刺激細胞因子的分泌[14]。因此,通常在IgA腎病患者中檢測到抗原和抗體免疫復合物的腎外來源。B細胞是主要的陽性調節(jié)因子,能夠產生抗原特異性免疫球蛋白和多種細胞因子[14-15]。MCCARTHY等[15]報道了一種過度表達BAFF的轉基因小鼠,該小鼠在存在共生菌群的情況下與人類IgA腎病高度相似。BAFF過度表達后,小鼠出現(xiàn)高循環(huán)水平的異常糖基化IgA、IgA系膜沉積、血尿和蛋白尿。而APRIL與BAFF具有高度同源性,其編碼基因TNFSF13被認為是IgA腎病的遺傳易感位點[4]。APRIL與其特異性受體BCMA結合后,可激活下游核因子-κB(NF-κB),然后刺激外周血B細胞產生免疫球蛋白[7]。本研究發(fā)現(xiàn),HSP組患兒血漿APRIL水平高于對照組,腎臟亞組血漿APRIL水平比其他3個亞組升高更顯著,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且血漿APRIL水平與血漿Gd-IgA1水平呈正相關,與外周血BCMA mRNA表達呈負相關。這些結果表明APRIL可能在HSP的發(fā)展中發(fā)揮重要作用,并且APRIL和Gd-IgA1有一定協(xié)同作用。

APRIL由多個細胞表達和分泌,包括單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞;而B細胞在其中發(fā)揮的作用更顯著,并且經(jīng)常參與自身免疫性疾病。ZHAI等[16]研究發(fā)現(xiàn),IgA腎病患者的B細胞中APRIL mRNA和BAFF mRNA表達顯著上調,但在T淋巴細胞中卻沒有。這可能意味著B細胞在決定血漿APRIL水平方面發(fā)揮更重要的作用。因此,本研究假設在HSP患兒的B細胞中,APRIL及其下游信號被激活。為了評估APRIL是否是HSP中Gd-IgA1增加的原因,本研究進一步分析了APRIL對體外試驗中Gd-IgA1產生的影響,結果發(fā)現(xiàn)HSP組患兒和對照組的淋巴細胞對APRIL的反應不同,經(jīng)APRIL預處理后,從HSP患兒體內分離的淋巴細胞上清液中,Gd-IgA1水平顯著高于對照組(P<0.05)。本研究體外試驗結果表明,APRIL在HSP組患兒Gd-IgA1產生中起一定作用。更重要的是,不僅APRIL,而且B細胞異常也可能導致HSP Gd-IgA1的升高,因為APRIL增加了HSP組患兒淋巴細胞中Gd-IgA1的生成。CD19+B細胞是產生IgA1的主要細胞[6-7],為了探討HSP患兒淋巴細胞異常的原因,在APRIL誘導的Gd-IgA1產生方面,檢測了CD19+B細胞中編碼APRIL受體的BCMA mRNA表達。在HSP患兒中,BCMA mRNA表達呈上調趨勢。本研究發(fā)現(xiàn),HSP患兒BCMA mRNA表達異常,Gd-IgA1水平升高,推測APRIL可能通過誘導BCMA mRNA的表達、增加Gd-IgA1的水平,并與它們協(xié)同作用來誘導和加劇組織損傷。

本研究結果發(fā)現(xiàn),血漿APRIL水平與Gd-IgA1水平呈正相關,體外實驗也證實APRIL可以在體外細胞培養(yǎng)模型中誘導異常糖基化IgA1分子的產生。此外,APRIL水平較高的患兒有更嚴重的臨床表現(xiàn),尤其是腎臟受累。本研究結果顯示,APRIL與HSP嚴重程度具有相關性,提示APRIL可能是促進Gd-IgA1產生的因素。

綜上所述,HSP患兒血漿APRIL水平升高,其水平與HSP疾病嚴重程度有相關性,其機制可能是APRIL與其B細胞中的受體有協(xié)同作用,可誘導Gd-IgA1的產生。