丹貝醬的抗氧化活性及風味成分分析

李夢茹 楊文清 李西西 李佳瑩 趙雪如 付瑋琦 李風娟

摘要：丹貝是一種以大豆為原料經根霉等發酵而制得的產品，文章采用后發酵工藝對鮮丹貝進行進一步加工得到衍生產品丹貝醬，考察了丹貝醬在后發酵過程中風味物質、抗氧化能力、總酚含量、總黃酮含量和游離氨基含量的變化。結果表明，丹貝經后發酵72 h后所得丹貝醬樣品水提物呈現良好的抗氧化活性，DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力分別為1.526，1.609，0.983 mg TE/g DW，總酚及總黃酮含量分別為1.811 mg GAE/g DW和0.113 mg CE/g DW；風味成分分析發現，后發酵72 h丹貝醬樣品中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛和2-正戊基呋喃的氣味活性值（OAV）較高，可被視為主要香氣成分，將為具有良好功能活性及感官品質的丹貝醬及其他丹貝衍生產品的開發提供基礎理論參考。

關鍵詞：后發酵；丹貝醬；抗氧化能力；酚類物質；風味

中圖分類號：TS264.24? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）04-0015-05

Abstract： Tempeh is is a product made from soybeans through the fermentation by Rhizopus. In this paper， the fresh tempeh is further processed by post fermentation to obtain the derivative product tempeh paste. The changes of flavor components， antioxidant capacity， the content of total phenols， total flavonoids and free amino groups of tempeh paste during post fermentation are investigated. The results show that the water extract of tempeh paste obtained after post fermentation for 72 h shows good antioxidant activity， with DPPH， ABTS radicals scavenging capacity and Fe3+ reducing capacity of 1.526， 1.609， 0.983 mg TE/g DW respectively. The content of total phenols and total flavonoids is 1.811 mg GAE/g DW and 0.113 mg CE/g DW respectively. Through the analysis of flavor components， it is found that 1-octene-3-ketone， 3-octanone， 1-octene-3-alcohol， nonanal and 2-n-pentylfuran in tempeh paste samples after post fermentation for 72 h have higher odor activity values （OAV）， which could be regarded as the main flavor components， would provide basic theoretical references for the development of tempeh paste and other tempeh derivative products with good functional activities and sensory quality.

Key words： post fermentation; tempeh paste; antioxidant capacity; phenolic substances; flavor

丹貝（tempeh）是一種以大豆為原料，經少孢根霉、米根霉等微生物發酵而成的大豆發酵制品，起始于印度尼西亞。與大豆相比，丹貝中氨基酸種類、大豆異黃酮苷元、煙酸、核黃素和維生素B12等生物活性成分均有所提高[1-2]?，F代研究發現，丹貝具有抗菌、抗氧化等生理調節功能[3-4]。丹貝在日本、歐洲、北美等發達國家和地區已日趨流行，對其衍生產品的研究也日益受到關注。

后發酵是發酵食品加工的一個重要工藝流程，指經過前發酵處理，物料在一定的溫度、時間等條件下，由微生物和酶的共同作用，對發酵基質中的大分子物質進行進一步分解，發生新的生化反應，從而有助于產品獨特風味、質地和組織狀態的形成，比如豆瓣醬、腐乳、酸奶等發酵食品在加工時所經歷的后熟過程[5]。有報道指出，豆豉的后發酵過程是改變其外觀狀態、形成獨特風味、增強生物活性、提高營養成分的關鍵工藝[6]；豆瓣在后熟過程中通過添加一定比例的水、辣椒和食鹽后，在微生物和酶的作用下形成其特有的風味[5]；茶經過后發酵處理，茶中的刺激物質減少，滋味醇厚甘甜，茶性平和，這為開發丹貝衍生產品提供了新的思路。

本研究對鮮丹貝進行后發酵處理制得丹貝醬產品，考察了丹貝醬在后發酵過程中抗氧化能力、總黃酮、總酚和游離氨基等的變化，并對其風味成分進行了分析，旨在為丹貝醬的研發提供理論指導，并促進丹貝衍生產品的開發及大豆發酵食品的進一步發展。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

去皮大豆：購于濰坊市天下糧倉食品有限公司；少孢根霉（Rhizopus oligosporus）：購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑及儀器設備

1.2.1 主要試劑

2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde， OPA）、沒食子酸（GA）、兒茶素（C）、Folin-Ciocalteu試劑：購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2.2 主要儀器

Model 1680酶標儀 瑞士Tecan公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

通過浸泡大豆、蒸煮、調酸、降溫、接種（孢子懸浮液濃度7.36×106 CFU/mL）、裝袋（扎孔）、前發酵（42 h）制作丹貝。將發酵好的丹貝切成小塊，加鹽水調制混勻（丹貝醬終產品含鹽量為4%），放于滅菌的玻璃罐中，將玻璃罐密封后放入30 ℃恒溫培養箱中，后發酵24，48，72 h后分別取樣。

1.3.2 樣品水提物的制備

稱取凍干后打粉的0.5 g丹貝醬粉末樣品與5 mL蒸餾水于10 mL離心管中混合，振蕩2 min，超聲5 min，30 ℃搖床1 h，然后于3 800 r/min離心15 min，用注射器吸取上清液后過0.45 μm濾膜得到樣液，樣品濃度標記為100 mg/mL。

1.3.3 抗氧化活性的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照Brand-Williams等[7]的方法。取5 μL濃度為25 mg/mL的樣液和195 μL濃度為0.079 mg/mL的DPPH反應液混合并于暗處反應30 min，測定517 nm波長下的吸光值，計算清除率，用Trolox為標準，將樣品結果表示為Trolox的毫克數（mg TE/g DW）。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力的測定

參照高一芳等[8]的方法。取5 μL濃度為25 mg/mL的樣液和200 μL的ABTS反應液混合反應30 min，測定732 nm波長下的吸光值，計算清除率，樣品結果表示為Trolox的毫克數（mg TE/g DW）。

1.3.3.3 FRAP還原能力的測定

參照高一芳等[8]的方法。取10 μL濃度為50 mg/mL的樣液和145 μL的TPTZ反應液混合后于37 ℃反應10 min，測定593 nm波長處的吸光值，樣品結果表示為Trolox的毫克當量數（mg TE/g DW）。

1.3.4 總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁顯色法，取30 μL濃度為50 mg/mL的樣液依次加入132 μL蒸餾水、9 μL 5% NaNO2溶液混合反應6 min后，再加入9 μL 10% AlCl3·6H2O溶液，放置5 min，再加入120 μL NaOH溶液混合反應，測定510 nm波長處的吸光值，將樣品結果表示為兒茶素的毫克數（mg CE/g DW）。

1.3.5 總酚含量的測定

取100 μL濃度為25 mg/mL的樣液依次加入80 μL福林酚、80 μL 10% Na2CO3溶液混合反應，37 ℃放置1 h，測定750 nm波長處的吸光值，將樣品結果表示為沒食子酸的毫克數（mg GAE/g DW）。

1.3.6 游離氨基的測定

OPA反應液的配制參考丁一[1]的方法，現配現用。取10 μL濃度為5 mg/mL的樣液，加入200 μL OPA反應液混合，暗反應2 min，以蒸餾水為對照，測定340 nm波長處的吸光值。以L-亮氨酸為標準，樣品游離氨基含量表示為g/100 g。

1.3.7 頂空固相微萃取及氣相色譜-質譜（GC-MS）檢測

將萃取頭（75 μm CAR/PDMS）于250 ℃的進樣口進行老化30 min的預處理。稱取4 g丹貝醬樣品于微萃取瓶中，加1 μL稀釋的2-甲基-3-庚酮，擰好封蓋，將磁力攪拌器調至60 ℃預熱10 min，萃取頭在60 ℃頂空吸附30 min。

程序設置：初溫40 ℃，持續3 min；終溫250 ℃，持續6 min，運行總時間50 min。進樣口溫度：250 ℃，載氣為He，流速為1 mL/min。電離方式為電子轟擊（EI）離子源，電離電壓70 eV，接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，質量掃描范圍35～500 amu。

1.3.8 風味物質的定性、定量標準

1.3.8.1 定性標準

第一，通過NIST 11譜庫分析，將檢測到的風味物質與NIST 11標準譜庫對比匹配，初步篩選風味物質；第二，根據風味物質在DB-WAX色譜柱上的線性保留指數（retention index，RI）計算獲得。

1.3.8.2 定量標準

采用面積歸一化法計算待測樣品風味物質的相對含量，并用內標法（內標為2-甲基-3-庚酮）精確定量丹貝中的風味物質。

1.3.9 氣味活性值

目前結合風味物質的閾值及其在體系中的濃度，是精確衡量其對食品貢獻大小的方法，即氣味活性值（odor activity value，OAV）。通常OAV≥1表示其對風味具有貢獻作用。風味物質的閾值通過已發表的書籍查詢。

1.3.10 統計分析

每組實驗重復測定3次。使用Origin 2019b繪制圖形，使用SPSS Statistics 26進行方差分析（P<0.05）。

2 結果與討論

2.1 后發酵過程中丹貝醬的抗氧化活性

丹貝醬后發酵過程中抗氧化能力的變化見圖1。

后發酵72 h丹貝醬樣品水提物的DPPH、ABTS自由基清除能力及Fe3+還原能力分別為1.526，1.609，0.983 mg TE/g DW，為樣品最高含量，隨著后發酵時間的延長，其DPPH、ABTS自由基清除能力和Fe3+還原能力均呈先降低后升高的趨勢。

丹貝中抗氧化物質主要是酚酸類、黃酮類、小分子肽、多糖和氨基酸類物質[9-12]。在后發酵過程中，丹貝醬中氨基酸可能與還原糖發生反應產生具有清除自由基能力的蛋白黑素類物質[13-14]，而丹貝醬抗氧化能力的變化可能是由于后發酵過程中丹貝醬中的酶活或蛋白酶水解程度改變，從而改變小分子肽的形成，因而對不同后發酵時間的丹貝醬樣品的抗氧化能力產生影響。

2.2 后發酵過程中丹貝醬的總黃酮、總酚含量

丹貝醬后發酵過程中總黃酮和總酚的含量變化見圖2。

后發酵48 h丹貝醬樣品水提物中總黃酮含量為0.147 mg CE/g DW，但隨著后發酵過程的進行，總黃酮含量略有下降；丹貝醬樣品水提物中總酚含量隨著后發酵時間的延長呈上升趨勢，后發酵72 h樣品的總酚含量為1.811 mg GAE/g DW，為樣品最高含量。酚類化合物通常以糖苷的形式和糖（主要是葡萄糖）結合，在后發酵過程中，β-葡萄糖苷酶、蛋白酶等由微生物分解代謝產生的水解酶物質可促進酚類游離態產物的形成，如葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的糖苷鍵，釋放出游離異黃酮苷元[15－16]，從而增加總黃酮含量，β-葡萄糖苷酶亦可催化丹貝底物釋放可提取的游離酚類化合物[17]，從而使總酚含量上升。

2.3 后發酵過程中丹貝醬的游離氨基含量

丹貝醬后發酵過程中游離氨基含量的變化見圖3。

隨著后發酵過程的繼續，丹貝醬樣品水提物中的游離氨基含量呈上升趨勢，后發酵72 h樣品中游離氨基含量最高，為0.231 g/100 g。在后發酵過程中，少孢根霉繼續增殖，蛋白酶活升高，其次，食鹽的添加使少孢根霉處于低氧環境，這為其發生應激反應分泌蛋白酶創造了條件，進一步促使蛋白質被分解為多肽及小分子氨基酸，使得游離氨基含量逐漸升高[18]。

2.4 后發酵過程中丹貝醬揮發性風味物質分析

2.4.1 主要揮發性物質OPLS-DA和差異物質分析

通過正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）后發酵丹貝醬中的主要揮發性物質，由圖4中a可知，丹貝醬每個組平行之間沒有較大差異。

由圖4中b可知，丹貝醬中的主要風味差異物質有11種，分別為1-辛烯-3-酮、正辛醛、乙醇、3-辛酮、2-正戊基呋喃、1-辛烯-3-醇、3-甲基-3-丁烯、1-石竹烯、2-乙基己醇、2，3-丁二醇、壬醛。丹貝醬中戊醛、己醛、正辛醛、2-正戊基呋喃和1-辛烯-3-醇等風味物質可能由亞油酸降解產生[19-20]；2，3-丁二醇可能與美拉德反應或者氨基酸的生物合成有關[21-22]；2-庚酮、1-辛烯-3-酮可能由微生物脂肪酶和氫過氧化物酶誘導的脂質氧化產生。

2.4.2 OAV分析

通過精確查找所檢測出的風味物質的閾值，結合GC-MS的物質含量結果，計算出各物質的氣味活性值。當OAV≥1時，認為該物質對食品的風味具有一定貢獻，故對后發酵丹貝醬樣品的OAV進行進一步研究，將有助于挖掘后發酵丹貝醬中的關鍵香氣成分。丹貝醬后發酵過程中氣味活性值熱圖見圖5。

丹貝醬后發酵過程中，后發酵24 h時樣品中OAV≥1的風味物質有22種，其中1-辛烯-3-酮、3-辛酮（有果實香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇的清香）的OAV較高；后發酵48 h時樣品中OAV≥1的風味物質有11種，其中1-辛烯-3-酮、正辛醛、1-辛烯-3-醇的OAV較高；后發酵72 h時樣品中OAV≥1的風味物質有20種，其中1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛（具有玫瑰、柑橘等香氣）的OAV較高，這些香氣成分對丹貝醬制品的風味具有重要貢獻。

3 結論

鮮丹貝經后發酵工藝處理后所得丹貝醬呈現良好的抗氧化活性，其中后發酵72 h時丹貝醬樣品水提物的DPPH、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力及總酚、游離氨基含量最高，且檢測到OAV≥1的風味物質有20種，1-辛烯-3-酮、3-辛酮、1-辛烯-3-醇、壬醛和2-正戊基呋喃對產品的風味產生有重要影響。后續研究將進一步考察后發酵過程中含鹽量、溫度等工藝參數對樣品功能品質、活性物質及風味成分生成的影響，為深入開發丹貝衍生品、推動大豆發酵食品產業發展提供更豐富的理論支撐。

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