基于斑馬魚模型的純綠青霉醇抗炎活性研究

李風玲 張云 李培海 李華 楊桂文 劉可春

摘要：目的 利用斑馬魚急性炎癥模型，對純綠青霉醇（viridicatol）抗炎作用及其機制進行初步研究。方法 采用硫酸銅（CuSO4）構(gòu)建斑馬魚急性炎癥模型，評價純綠青霉醇的抗炎活性。將炎癥狀態(tài)下的斑馬魚（3 dpf）暴露在不同濃度的純綠青霉醇（30、60和90 μg/mL）中2 h，布洛芬（ibuprofen，IBF）作為陽性對照，觀察斑馬魚神經(jīng)側(cè)線炎癥細胞遷移和聚集的數(shù)量變化情況并計算熒光強度；利用RT-PCR技術(shù)測定各組斑馬魚炎癥相關基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果 與炎癥模型組相比，布洛芬組和純綠青霉醇組斑馬魚炎癥細胞遷移和聚集的數(shù)量以及熒光強度均顯著降低，同時30、60、90 μg/mL劑量下的純綠青霉醇能顯著提高pparγ的mRNA表達水平，抑制炎癥相關因子iκbαa、ap-1、nf-κb、il-1b、il8、ptges和myd88的mRNA表達。結(jié)論 本研究通過建立斑馬魚急性炎癥模型探究了純綠青霉醇的抗炎作用，首次發(fā)現(xiàn)其機制可能是純綠青霉醇激活pparγ表達，抑制nf-κb和ap-1轉(zhuǎn)錄活性，降低炎癥因子表達，從而緩解炎癥，為純綠青霉醇的應用開發(fā)提供了新思路。

關鍵詞：純綠青霉醇；斑馬魚；抗炎；作用機制

中圖分類號：R9 ?文獻標志碼：A

Anti-inflammatory activity of viridicatol based on zebrafish model

Li Feng-ling1，2，3， Zhang Yun2，3， Li Pei-hai2，3， Li Hua1， Yang Gui-wen1 and Liu Ke-chun2，3

（1 School of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014;

2 Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences）Institute of Biology， Jinan 250103;

3 Engineering Research Center og Zebrafish Models for Human Diseases and Drug Screening of Shandong ， Jinan 250103））

Abstract Objective The anti-inflammatory effect and mechanism of viridicatol were studied by using zebrafish acute inflammation model. Methods The acute inflammation model of zebrafish was constructed with CuSO4 to evaluate the anti-inflammatory activity of viridicatol. zebrafish （3 dpf） in inflammatory state were exposed to different concentrations of viridicatol （30， 60， or 90 μg/mL） for two hours， with ibuprofen as a positive control. The migration and aggregation of ?inflammatory cells in zebrafish nerve lateral line were observed， and the fluorescence intensity was calculated. The transcription levels of inflammation related genes in zebrafish were measured by RT-PCR. Results ? ?Compared with the inflammation model group， the number and fluorescence intensity of inflammatory cell migration and aggregation in zebrafish in ibuprofen group and viridicatol group were significantly reduced. At the same time， viridicatol at the dose of 30， 60， or 90 μg/mL could significantly increase the mRNA level of pparγ and inhibit the mRNA expression of inflammation related factors， such as iκbαa、ap-1、nf-κb、il-1b、il8、ptges and myd88. Conclusion ?This study explored the anti-inflammatory effect of viridicatol by establishing an acute inflammation model of zebrafish. It was found for the first time that the mechanism may be viridicatol activating the expression of pparγ， inhibiting the transcription activities of nf-κb and ap-1， and reducing the expression of inflammatory factors， so as to alleviate inflammation， which provides a new idea for the application and development of viridicatol.

Key words Viridicatol; Zebrafish; Anti-inflammatory; Mechanism

炎癥是對外來生物體（包括人類病原體、塵埃顆粒和病毒）的一系列全面的生理反應[1]，是多細胞因子通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎系統(tǒng)之間的平衡而參與炎癥發(fā)生、發(fā)展的過程。但過度炎癥或長時間的慢性炎癥會造成免疫系統(tǒng)對機體自身正常組織的攻擊，使機體正常功能受到損傷，甚至引發(fā)一系列的病理反應[2]。研究表明，多種疾病都與炎癥反應相關，例如靜脈和慢性動脈疾病、急性腦卒中[3]、心肌缺血[4]、阿爾茲海默癥、癌癥[5-6]和動脈高血壓[7]。此外，在高度抑郁患者中也有一些炎癥指標[8]。與炎癥分子介質(zhì)相關的疾病數(shù)量巨大且不斷擴大，基于已有抗炎藥物的副作用和耐藥性，以及炎癥類型的復雜性，研發(fā)高效低毒的新型抗炎藥物符合臨床需求。近年來，從海洋來源的曲霉中發(fā)現(xiàn)了大量的新次生代謝產(chǎn)物，如聚酮、生物堿、萜烯、甾體和肽等[9]，并表現(xiàn)出抗菌、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種生物活性[10]。本實驗室從曲霉中分離獲得已知化合物純綠青霉醇，并初次發(fā)現(xiàn)其具有抗炎活性[11]，但對其機制尚不明確，因此，本研究首次對純綠青霉醇的抗炎作用機制進行初步研究，以期獲得具有成藥潛力的海洋抗炎先導化合物，對于探索海洋生物資源挖掘利用具有重要借鑒意義。

近年來，隨著斑馬魚（Danio rerio）藥物篩選模型的多樣化和日益成熟，正越來越多的用于藥物先導分子的發(fā)現(xiàn)。斑馬魚的生理結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動物高度相似，與人類基因同源性達87%。作為模式生物，具有飼養(yǎng)成本低、發(fā)育周期短、體積小、透明易觀察、用藥量低等優(yōu)勢，特別適用于天然產(chǎn)物的活性篩選評價和作用機制研究[12]。本實驗采用硫酸銅誘導法建立斑馬魚炎癥模型，研究純綠青霉醇的抗炎活性及作用機制，為純綠青霉醇的應用開發(fā)提供參考。

1 純綠青霉醇的分子結(jié)構(gòu)

純綠青霉醇（圖1）[11，13]是從海洋真菌澳大利亞曲霉（Aspergillus austroafricanus）Y32-2的次級代謝產(chǎn)物中分離出來的一種喹啉酮類生物堿，分子式為C15H11NO3。

2 材料與儀器

2.1 樣品和試劑

純綠青霉醇由山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選實驗室從海洋真菌代謝產(chǎn)物中分離鑒定所得。

硫酸銅購自國藥集團化學試劑有限公司，質(zhì)量分數(shù)為99.0%；布洛芬購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%；RNA提取試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；實驗用水為斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水（5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4）。

2.2 儀器

SZX16 型熒光顯微鏡及DP2-BSW圖像采集系統(tǒng)購自日本奧林巴斯公司；體視顯微鏡AXIO Zoom V16購于德國蔡司公司；實時熒光定量PCR儀購于美國羅氏公司；斑馬魚養(yǎng)殖飼養(yǎng)設備購于北京愛生科技公司。

3 方法

3.1 實驗動物的獲取

本實驗采用由山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供的成熟綠色熒光標記炎癥細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg（zlyz： EGFP），雌雄斑馬魚在28℃標準條件下、照明14 h/黑暗10 h分開飼養(yǎng)。用卵時，選取健康性成熟的斑馬魚，按照雌： 雄為1：1或1：2的數(shù)量比放入交配缸內(nèi)，第二天抽板交配，10時至11時獲得受精卵，將受精卵清洗并消毒，移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水中，28℃下控光培養(yǎng)。

3.2 硫酸銅誘導斑馬魚炎癥模型及步驟

將發(fā)育至3 dpf的斑馬魚從培養(yǎng)箱中取出，在顯微鏡下隨機挑取熒光正常的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，移入6孔板中，每孔40尾，分別設置空白組、模型組、陽性藥布洛芬（ibuprofen）組和純綠青霉醇（viridicatol）組。在藥物作用2 h后，向除空白組外的各組分別加入硫酸銅（CuSO4），使CuSO4作用濃度為20 ?mol/L，作用1 h后，在熒光顯微鏡下拍照觀察斑馬魚神經(jīng)側(cè)線炎癥細胞的遷移情況，統(tǒng)計熒光強度變化以及遷移至側(cè)線的炎癥細胞個數(shù)。

3.3 實時熒光定量PCR測定炎癥相關基因的mRNA水平

將給藥后的斑馬魚用PBS清洗后，放入勻漿器中勻漿，利用試劑盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2提取RNA。將各組樣本RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用BIO-RAD CFX96實時系統(tǒng)測定與炎癥相關基因的表達量，分3個重復進行。

實時定量PCR擴增反應條件為95℃預變性30 s 1個循環(huán)后，變性95℃ 10 s，退火60℃ 10 s，共40個循環(huán)后，最后95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s 1個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參對結(jié)果進行相對定量分析。內(nèi)參基因β-actin以及目的基因的PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成、純化，并經(jīng)質(zhì)量檢測。相關基因引物設計見表1。

3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運用軟件GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以（x±s）表示。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

4 結(jié)果

4.1 純綠青霉醇對硫酸銅引起的炎癥細胞聚集的影響

利用CuSO4損傷斑馬魚體表側(cè)線器的末梢器官——神經(jīng)丘，造成斑馬魚炎癥細胞向神經(jīng)丘周圍（側(cè)線部位）遷移，建立CuSO4誘導的斑馬魚炎癥模型，通過計算遷移到斑馬魚側(cè)線部位的炎癥細胞數(shù)目以及熒光強度變化情況來評價化合物的抗炎活性。如圖2～3所示，空白組與DMSO組的炎癥細胞遷移情況無顯著性差異；與空白對照組相比，硫酸銅模型組斑馬魚遷移至側(cè)線的炎癥細胞數(shù)量顯著增多，硫酸銅導致斑馬魚體內(nèi)發(fā)生炎癥反應。陽性藥（布洛芬）組和30、60和90 μg/mL純綠青霉醇組斑馬魚機體內(nèi)遷移至側(cè)線部位的炎癥細胞數(shù)量，與硫酸銅模型組相比顯著降低。同樣，與模型組相比，陽性藥組和30、60和

90 μg/mL純綠青霉醇組斑馬魚熒光強度顯著降低。

4.2 純綠青霉醇對斑馬魚炎癥相關基因表達水平的影響

實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，硫酸銅模型組斑馬魚中nf-κb、iκbαa、ap-1和mapk8的mRNA表達升高（P<0.05），炎癥因子il-1b、il8、ptges和myd88的mRNA表達顯著升高（P<0.05），pparγ的mRNA表達顯著下降。與模型組相比，30、60和90 μg/mL純綠青霉醇組基因ptges、il-1b和ap-1的mRNA表達量顯著降低并呈劑量依賴性，基因pparγ的mRNA表達量呈劑量依賴性顯著升高。與模型組相比，30、60和90 μg/mL純綠青霉醇組nf-κb、il8的mRNA表達顯著降低，60和90 μg/mL純綠青霉醇組iκbαa、myd88的mRNA表達顯著降低，90 μg/mL純綠青霉醇組基因mapk8的mRNA的表達量顯著降低，見圖4。

5 討論

布洛芬屬于非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID），是臨床上第一個被用于抗炎的丙酸衍化物類制劑，具有類似于阿司匹林的藥理特性，并且其對胃的不良影響較小。已有研究[14]發(fā)現(xiàn)：布洛芬具有對全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）患兒血清炎癥因子進行早期干預的功效，能夠抑制白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）生成增多、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的釋放等。因此，目前已有多項抗炎研究[11，15]將布洛芬作為陽性對照藥，以評價目的化合物的抗炎活性。

純綠青霉醇具有抗過敏、抗菌和抗腫瘤[16]等多種活性。Shu等[17]通過建立卵清蛋白誘導的食物過敏小鼠模型和大鼠嗜堿性粒細胞白血病（rat basophil leukemia，RBL）-2H3細胞模型發(fā)現(xiàn)從深海灰黃青霉中分離出的純綠青霉醇通過抑制肥大細胞活化來減輕過敏反應并修復小鼠的腸道屏障。本實驗利用斑馬魚炎癥模型研究了純綠青霉醇的抗炎活性和作用機制。采用硫酸銅造成斑馬魚炎癥模型的方法，與對照組相比，造模后斑馬魚體內(nèi)炎癥細胞遷移或聚集數(shù)量顯著增多，表明斑馬魚產(chǎn)生炎癥反應。向斑馬魚暴露2 h的不同濃度純綠青霉醇（30、60和90 μg/mL）溶液中加入硫酸銅作用1 h，結(jié)果顯示，與炎癥模型組相比，各化合物組斑馬魚體內(nèi)炎癥細胞遷移和聚集數(shù)量顯著減少，表明化合物純綠青霉醇具有抗炎活性。

銅作為先天性免疫系統(tǒng)中的一個重要成分，可以通過活性氧（reactive oxygen species，ROS）等途徑誘導氧化應激調(diào)節(jié)炎癥反應。硫酸銅誘導的斑馬魚急性炎癥模型是目前斑馬魚實驗通常采用的模擬免疫系統(tǒng)對于炎癥的應激過程的方法之一，是無創(chuàng)傷性的[18]。在斑馬魚的成魚和幼魚中，硫酸銅可以刺激斑馬魚炎癥細胞向神經(jīng)隆起迅速遷移，具有抗炎活性的化合物可以抑制這一遷移，使炎癥細胞返回，利用這一結(jié)果來評價化合物是否具有抗炎活性。Zhang等[19]將炎癥狀態(tài)斑馬魚暴露于不同濃度異煙肼（isoniazid，INH）中，觀察斑馬魚炎癥細胞遷移和聚集變化情況，1、2和4 mmol/L INH組斑馬魚機體中遷移至側(cè)線部位的炎癥細胞數(shù)量，與硫酸銅模型組比顯著降低（P＜0.05），驗證了INH具有抗炎作用，為異煙肼的臨床應用提供了參考。本實驗采用相同的CuSO4造模方法驗證了純綠青霉醇具有抗炎活性。

白細胞介素1b（interleukin-1b，IL-1b）由活化的巨噬細胞產(chǎn)生，是炎癥反應的重要介質(zhì)[20]。白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）可以吸引和激活中性粒細胞，導致中性粒細胞產(chǎn)生一系列活性分子并引起炎癥反應[21]。前列腺素E2合成酶（prostaglandin E2 synthase，ptges）是一種調(diào)節(jié)前列腺素E2生成的重要酶，前列腺素E2是公認的炎癥預后標志物，在炎癥反應中常被視為治療靶點[22-23]。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）轉(zhuǎn)錄因子家族是天然免疫和獲得性免疫反應的關鍵參與者，是炎癥過程的中心介質(zhì)[24-25]。分布在真核細胞中的NF-κB抑制劑α（inhibitor of NF-κB alpha，iκbα）是iκb的家族成員之一。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與iκb聚合，以非激活形式存在于細胞核外；當受到細胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物和促炎細胞因子等因素的刺激時，iκb降解，NF-κB跨過細胞膜進入細胞核，與有NF-κB結(jié)合位點的基因結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄進程[26]。激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是一個統(tǒng)稱，指的是由Jun，F(xiàn)os或激活轉(zhuǎn)錄因子（activating transcription factor，ATF）亞基組成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，這些亞基與共同的DNA位點（AP-1結(jié)合位點）結(jié)合，AP-1在炎癥反應中具有誘導細胞凋亡，增加黏附因子和炎性因子合成等功能[27-28]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是核激素受體家族中的配體激活受體，是炎癥反應中的關鍵負反饋調(diào)節(jié)器[29]，可通過信號轉(zhuǎn)導途徑抑制炎癥反應，比如PPAR γ與NF-κB形成轉(zhuǎn)錄抑制復合物，抑制NF-κB與DNA相互作用，進而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[30-31]。與此一致，硫酸銅暴露后斑馬魚體內(nèi)pparγ的mRNA表達呈下降趨勢。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路由4個不同的級聯(lián)反應共享，包括細胞外信號激酶（extracellular signal-related kinases，ERK1 / 2），Jun氨基末端激酶（Jun amino-terminal kinases，JNK1/2/3），p38-MAPK和ERK5[32]，與細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程有關。髓系分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）可介導多種Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）、白介素1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）、白介素18受體（interleukin-18 receptor，IL-18R），是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要接頭蛋白，MyD88信號轉(zhuǎn)導通路是參與機體炎癥反應的一種重要信號通路，具有調(diào)控炎性因子生成與釋放的作用，抑制該信號通路的激活，可有效抑制促炎因子的分泌[33-34]。本研究給予硫酸銅誘導的炎癥模型不同濃度純綠青霉醇干預后，結(jié)果顯示，斑馬魚組織中pparγ的表達顯著增加，炎癥介質(zhì)nf-κb、ap-1、il-1b、il8、myd88、iκbαa和ptges的表達明顯降低，從而達到緩解炎癥的效果，而mapk8的表達量并沒有降低，猜測可能是化合物純綠青霉醇并不通過此通路來調(diào)節(jié)炎癥反應。

綜上所述，本實驗的研究結(jié)果表明純綠青霉醇具有一定的抗炎作用。其機制可能是純綠青霉醇激活pparγ表達，抑制nf-κb和ap-1轉(zhuǎn)錄活性，降低炎癥因子表達，從而緩解炎癥（圖5）。本實驗首次在斑馬魚模型中系統(tǒng)的探究了純綠青霉醇的抗炎活性和作用機制，為純綠青霉醇的深入研究奠定基礎，也為海洋來源天然產(chǎn)物的有效利用提供了新思路。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-03-09

基金項目：齊魯工業(yè)大學生物及生物化學ESI培育學科開放課題（No. ESIBBC202002），濟南市“高校20條”資助項目（No. 2020GXRC053， No. 2021GXRC047），齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）科教產(chǎn)融合創(chuàng)新試點工程項目（No. 2020KJC-ZD08）

作者簡介：李風玲，女，生于1995年，在讀碩士研究生，研究方向為基于斑馬魚模型的藥物活性篩選與安全性評價，E-mail： 17853532669@163.com

通訊作者，楊桂文，E-mail： yanggw@sdnu.edu.cn; 劉可春，E-mail： hliukch@sdas.org.