基于生物信息學篩選卵巢癌患者預后的相關趨化因子并構建預后模型△

楊志新，覃淑一，鄒丹，楊麗華

昆明醫科大學第二附屬醫院婦科，昆明 650101

卵巢癌是病死率最高的婦科腫瘤，2020年全球新增卵巢癌病例31.4 萬例，病死超過20.7 萬例，病死率達60%[1]。由于缺乏有效的篩查手段，卵巢癌確診時多已進展至晚期，5年總生存率不足50%[2]，且超過70%的晚期卵巢癌患者會出現化療耐藥，預后較差[3]，因此，研究卵巢癌惡性生物學行為的相關影響因子，尋找更有效的早期診斷、預后預測的方法和指標，具有重要意義。腫瘤微環境已被證實在大多數腫瘤的發生、發展中具有重要作用[4]。腫瘤微環境中存在多種活性細胞和活性分子，它們共同構成復雜的信號網絡調控體系。間質細胞與腫瘤細胞的協同作用是腫瘤微環境的重要部分，趨化因子及其受體構建了腫瘤細胞與間質細胞之間的信號體系，是細胞遷移、趨化過程中的重要超家族。趨化因子及其受體通過抑制或刺激免疫系統促進或抑制腫瘤進展，與患者的預后密切相關[5]。免疫細胞也是腫瘤微環境的重要組成部分，腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）在不同趨化因子的刺激下可極化為M1 型和M2 型，M1 型巨噬細胞為抗腫瘤巨噬細胞，可誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖、遷移和新生血管生成；M2 型巨噬細胞為親腫瘤細胞，可促進腫瘤的生長和轉移[6]。中性粒細胞自身可以釋放多種細胞因子和趨化因子，這些細胞因子和趨化因子可以決定中性粒細胞自身的親腫瘤或抗腫瘤行為，在腫瘤微環境中呈現抗腫瘤性的N1 型和親腫瘤性的N2 型[7-8]。趨化因子與免疫細胞的關系復雜且緊密，探究二者之間相互影響的作用機制對研究腫瘤的發生發展、轉移有重要意義。目前，包含基因表達和臨床特征的大規模公開數據為分析卵巢癌患者的預后提供了更便利的條件。本研究基于生物信息學方法分析卵巢癌患者預后的相關趨化因子，構建多基因預后模型，并分析其與趨化因子相關的免疫細胞功能，旨在探討趨化因子在卵巢癌預后評估中的意義，為卵巢癌的診療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集及處理

從基因型-組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數 據 庫（https://www.gtexportal.org/home/）下載108 例正常卵巢組織數據及臨床資料。從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫SangerBox 界面（http://sangerbox.com/）下載379 例卵巢癌組織數據及臨床資料，其中有4 份樣本為同一卵巢癌患者取樣兩次所得，在進行生存分析時被去除，另外3 份非原發樣本也被去除。采用R 語言載入factoextra 包對卵巢癌組織和正常卵巢組織的數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）降維處理，采用sva 軟件包對數據歸一化，并對樣本進行質控評估及預處理。此外，從GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）收集48個以“X-C Motif Chemokine”“C-C Motif Chemokine”“C-X-C Motif Chemokine”“C-X3-C Motif Chemokine”開頭的趨化因子，進行差異分析及后續的模型構建。

1.2 差異趨化因子的篩選

載入經歸一處理后的數據，采用R 語言的Limma 包比較GTEx（正常卵巢組織樣本）和TCGA（卵巢癌組織樣本）獲取樣本中差異表達的基因（篩選標 準：P≤0.05 且|log2FC|≥1），并采用R語言的pheatmap 包繪制差異基因聚類熱圖。載入所有差異表達基因及下載的趨化因子數據，利用Intersect函數分析卵巢癌中差異表達的趨化因子，結果以韋恩圖進行展示。

1.3 預后模型的構建與評價

通過單因素Cox 比例風險回歸分析篩選與卵巢癌患者預后有關的趨化因子，采用R 語言的Survival 包的coxph 函數構建預后模型，然后通過多因素Cox 比例風險回歸分析得到最優模型。采用Survival 包中的predict 函數計算卵巢癌風險評分中位數，并以此將卵巢癌患者分為高風險組和低風險組，繪制Kaplan-Meier 曲線分析兩組患者的總生存期（overall survival，OS），組間比較采用Log-rank檢驗。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估趨化因子模型對卵巢癌患者預后的預測價值。

1.4 趨化因子與免疫浸潤細胞的相關性分析

在CIBERSORTx 網站（https://cibersort.stanford.edu/）中上傳TCGA 數據庫下載的所有卵巢癌組織樣本數據，比較高風險組與低風險組卵巢癌組織樣本中免疫浸潤細胞的比例，并使用R 語言Hmisc包中rcorr 函數分析建模趨化因子與免疫浸潤細胞的相關性。

2 結果

2.1 TCGA 及GTEx 數據庫組織樣本質控

整合TCGA 和GTEx 數據庫下載的數據，經PCA 降維后的卵巢癌組織和正常卵巢組織的數據在二維主成分圖中各自聚集較好，即組內一致性較好，且組間具有較好區分度，說明該數據可進行后續分析。（圖1）

2.2 差異趨化因子的篩選

比較卵巢癌組織和正常卵巢組織中的基因表達 情 況，共 發 現6813 個差異基因（P≤0.05 且|log2FC|≥1），其中表達上調3085 個，表達下調3728個。分析6813 個差異基因與48 個趨化因子之間的基因交叉情況發現，卵巢癌組織與正常卵巢組織中存在27 個差異表達的趨化因子，分別為CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL14、CCL20、CCL21、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXC 趨化因子配體（C-X-C chemokine ligand，CXCL）1、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL17、XC趨化因子配體2（X-C chemokine ligand 2，XCL2）。（圖2）

圖2 正常卵巢組織和卵巢癌組織差異表達基因和趨化因子的韋恩圖

2.3 卵巢癌預后相關趨化因子挖掘

繪制Kaplan-Meier 曲線，依據趨化因子表達量中位值將372 例卵巢癌患者分為高表達組和低表達組，分組均為高表達組186 例，低表達組186 例。采用單因素Cox 比例風險回歸模型分析差異表達的趨化因子與卵巢癌患者OS 的關系，結果發現，卵巢癌組織中CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13這6個趨化因子的表達情況與卵巢癌患者的OS 有關（P﹤0.05），趨化因子表達水平越高，患者的預后越好。（圖3）

圖3 各趨化因子不同表達情況卵巢癌患者的OS曲線

2.4 趨化因子相關預后模型的構建

將卵巢癌預后相關的趨化因子CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13納入多因素Cox 比例風險回歸模型分析，選取前4 個趨化因子（CXCL10、CXCL11、CXCL13和CCL25）構建預后模型（表1），由預后模型得出生存風險評分中位數，并以此將卵巢癌患者分為高風險組（n=186）和低風險組（n=186），結果顯示，高風險組卵巢癌患者的OS 短于低風險組患者，差異有統計學意義（P﹤0.05）（圖4）。繪制ROC 曲線評估該模型對卵巢癌患者預后的預測效能，結果顯示，該預測模型預測卵巢癌患者1年、3年及5年預后的AUC 分別為0.563（95%CI：0.519～0.607）、0.617（95%CI：0.562～0.672）、0.653（95%CI：0.615～0.691），具有較好的預測效能（圖5）。

表1 CXCL10、CXCL11、CXCL13和CCL25預測卵巢癌患者預后的多因素Cox回歸模型

圖4 高風險組（n=186）和低風險組（n=186）卵巢癌患者的OS曲線

圖5 趨化因子模型預測卵巢癌患者預后的ROC曲線

2.5 卵巢癌預后相關趨化因子與卵巢癌患者免疫浸潤細胞的相關性分析

通過CIBERSORTx 網站分析卵巢癌組織中免疫浸潤細胞的分布情況、高風險組與低風險組卵巢癌患者各免疫浸潤細胞的比例，結果發現，高風險組卵巢癌患者卵巢癌組織中M2 型巨噬細胞、活化的樹突狀細胞和中性粒細胞比例均高于低風險組患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。卵巢癌預后模型中CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL25的表達與M1 型巨噬細胞均呈正相關（P﹤0.05），CCL25的表達與M2 型巨噬細胞呈負相關（P﹤0.01），CXCL13的表達與成熟樹突狀細胞呈負相關（P﹤0.01），CCL25、CXCL13的表達與中性粒細胞均呈負相關（P﹤0.05）。（表2）

表2 CXCL10、CXCL11、CXCL13 和CCL25 與主要免疫浸潤細胞的相關性

3 討論

1990—2019年，中國卵巢癌發病率逐年升高，標化發病率與粗發病率平均每年分別上升2.03%、3.85%[9]，因此，尋找有效的生物標志物預測卵巢癌患者的預后對卵巢癌患者的治療和管理非常重要。卵巢癌的腫瘤微環境與腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移密切相關，而趨化因子在上述過程中也發揮重要作用[10]，但目前關于趨化因子與卵巢癌患者預后關系的研究還很少。本研究基于生物信息學的方法篩選出27 個在卵巢癌組織與正常卵巢組織間差異表達的趨化因子，進一步分析發現，其中6個趨化因子與卵巢癌患者的預后有關，分別為CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11及CXCL13。

趨化因子是一類能趨化細胞定向移動的小分子分泌蛋白，與其受體共同構成復雜的網絡，介導免疫細胞招募，形成免疫抑制或免疫促進，影響腫瘤的發生發展過程。CCL8是趨化因子家族成員，可以在炎癥反應和腫瘤免疫等方面發揮重要作用，在腫瘤微環境中發揮重要作用[11]。CCL25及其受體——趨化因子受體9（CC chemokine receptor 9，CCR9）能夠抑制結直腸癌細胞的侵襲和轉移[12]；CCL25高表達預示三陰性乳腺癌患者的預后良好[13]，阻斷CCR9/CCL25通路可促進腫瘤進展和遠處轉移[14-15]。CXCL10是由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-γ誘導產生的一類趨化因子，其高表達與直腸癌[16]、胃癌[17]、肝細胞癌[18]等患者更好的預后相關。CXC 趨化因子受體3（CXC chemokine receptor 3，CXCR3）是CXCL10基因的唯一受體，研究表明，CXCR3 與其配體CXCL10、CXCL9 結合對高級別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSC）患者的預后會產生正向影響，是晚期HGSC的有利預后指標[19]。CXCL11也表現為有利于腫瘤患者的預后，γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和TNF-α可誘導CXCL11和CXCL9的分泌增加，并在甲狀腺乳頭狀癌中表現為抗腫瘤細胞增殖作用[20]，但與卵巢癌的關系尚未見報道。CXCL13已在乳腺癌[21]、結直腸癌[22]等多種實體腫瘤中證實為有利于患者的預后，CXCL13可以在HGSC 中形成免疫活性腫瘤微環境并增強程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）檢查點阻斷的效果[23]。本研究發現，卵巢癌組織中CCL8、CCL25、CXCL9、CXCL10、CXCL11及CXCL13的表達情況與卵巢癌患者的預后有關，提示上述基因有潛力成為卵巢癌患者的預后標志物，但其確切作用尚需進一步進行功能和機制研究探索。隨后本研究篩選其中4 個趨化因子構建卵巢癌預后模型，該預測模型預測卵巢癌患者OS 的價值較高。

為了解趨化因子在卵巢癌中的作用機制，本研究分析了不同生存風險評分及建模趨化因子與腫瘤免疫浸潤細胞間的關系，結果顯示，高風險組卵巢癌患者卵巢癌組織中巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞比例均高于低風險組患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。研究表明，高密度的M2 型巨噬細胞與上皮性卵巢癌患者較差的預后和較低的總生存率有關，而高M1/M2 型巨噬細胞比例則預示著卵巢癌患者更好的預后[24-25]。樹突狀細胞是免疫系統的前哨細胞，通常提供常規的T 細胞刺激信號，從而激發強大的抗腫瘤免疫反應[26]，人和小鼠晚期卵巢腫瘤中雖然伴有大量的成熟樹突狀細胞浸潤，且能夠表達相對較高水平的共刺激分子，但始終表現出抗原提呈能力缺失，最終阻斷了腫瘤內T 細胞的局部活化和擴增，導致腫瘤進展[27]。中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil-tolymphocyte ratio，NLR）是腫瘤患者預后的獨立影響因素。劉楠等[28]發現，高NLR 水平卵巢癌患者的OS 較短，且高NLR 與卵巢癌患者國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期晚、腹腔積液及化療敏感性降低有關。本研究發現，CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL25的表達與M1 型巨噬細胞均呈正相關（P﹤0.05），CCL25的表達與M2 型巨噬細胞呈負相關（P﹤0.01），CXCL13的表達與成熟樹突狀細胞呈負相關（P﹤0.01），CCL25、CXCL13的表達與中性粒細胞均呈負相關（P﹤0.05）。提示卵巢癌微環境中趨化因子CXCL11、CXCL13、CCL25可能介導了巨噬細胞、中性粒細胞等免疫浸潤細胞的數量增加，從而提高了抗腫瘤免疫效應，解除免疫抑制，減緩卵巢癌進展，有利于卵巢癌患者的預后。

綜上所述，基于生物信息學方法篩選趨化因子構建卵巢癌患者預后的多因素Cox 回歸模型，并發現CXCL10、CXCL11、CXCL13和CCL25這4 個趨化因子與免疫浸潤細胞有關，有助于對卵巢癌患者進行分層并預測其預后生存情況，為卵巢癌的后續研究提供了新見解。