Graves眼病患者血漿細胞因子濃度與臨床活動度的相關性分析

謝榮榮 史婷婷 信 中 曹 曦 楊金奎,*

(1. 北京市糖尿病研究所/北京市糖尿病防治辦公室,北京 100730; 2. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科,北京 102600)

Graves眼病(Graves’ ophthalmopathy, GO)是一種器官特異性自身免疫疾病,發病率居成年人眼眶病的首位。其病理生理機制是眼眶組織糖胺聚糖的堆積導致球后結締組織增生及眼外肌水腫,從而引起眼球突出、復視、斜視及視神經受壓等臨床表現[1-2]。根據疾病活動性可將GO分為活動期及非活動期。在活動期,病理表現為淋巴細胞浸潤及成纖維細胞的活化; 非活動期,病理表現為眼外肌纖維化[3]。根據疾病的活動性,臨床醫生采取不同的治療措施。目前臨床上活動性評價受到患者自身和醫師工作經驗等主觀性因素的影響,因此尋找合適的客觀性生物標志物評價GO的活動性尤為重要。

細胞因子是機體免疫應答過程中細胞分泌的具有廣泛生物學活性的異質性調節因子[4]。目前,細胞因子分為五類:干擾素群系(interferons, IFNs)、白細胞介素群系(interleukins, ILs)、克隆刺激因子群系(colony-stimulating factors,CSFs)、轉化因子群系(transforming growth factors, TGFs)和腫瘤壞死因子群系(tumor necrosis factors, TNFs)[5-6]。研究[4]表明,細胞因子在GO的發生發展中發揮重要的作用。本研究通過檢測活動期及非活動期GO患者血漿中的12項細胞因子[包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、IFN-α、IFN-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α]濃度,分析這些因子與疾病活動度等指標的相關性,為GO的治療提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2021年1月至2023年1月在首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科門診就診的GO患者27例。GO患者入組標準:①結合臨床癥狀、實驗室檢查及影像學檢查,所有患者均按照Bartley標準診斷明確;②所有患者均應用甲巰咪唑片(德國默克公司,國藥準字J20171078,規格10 mg/片)治療;③所有患者均未接受過眼部疾病治療,包括糖皮質激素、免疫抑制劑、放射治療及手術治療;④18歲≤年齡<70歲;⑤神志清楚,配合隨訪。GO排除標準:①甲狀腺功能異常者;②既往對抗甲狀腺藥物過敏,有放射性碘或甲狀腺手術治療史;③1個月前抗生素及免疫抑制劑或激素類藥物使用史;④合并其他自身免疫性疾病;⑤妊娠期或哺乳期女性;⑥合并其他嚴重原發性疾病,包括糖尿病、高血壓、高血脂等;合并惡性腫瘤以及酒精及其他藥物依賴史,伴有精神障礙及認知障礙。根據臨床活動性評分(Clinical Activity Score,CAS)及美國甲狀腺學會頒布的分級標準(0: no signs or symptoms;1:only signs, no symptoms;2:soft tissue involvement;3:proptosis;4:expraocular muscle involvement;5:cornea involvement;6:sightloss, NOSPECS)對患者進行疾病活動期分期,將其中CAS≥3分的14例患者為活動期組(病例組),CAS<3分的13例患者為非活動期組(對照組)。研究方案符合人體試驗倫理學標準,并得到首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會的批準(批準號TRECKY2016-003);所有納入本研究的患者均簽署了知情同意書。

1.2 資料收集

內容包括性別、年齡、吸煙史、肝腎功能、甲狀腺功能檢查、甲狀腺自身抗體及患者用藥史。

1.3 實驗室檢測

1.3.1 血清甲狀腺激素測定

血清甲狀腺激素[游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine,FT4)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、四碘甲腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)]和促甲狀腺激素 (thyroid stimulating hormone,TSH)的檢測在 ADVIA Centaur XP Immunoassay系統平臺中進行(西門子公司,德國)。促甲狀腺素受體抗體(thyrotropin receptor antibody,TRAb)滴度的測定采用電化學發光法(Roche公司, 德國)。參考范圍(FT3:3.50～6.50 pmol/L,FT4:11.50～22.70 pmol/L,T3: 0.92～2.97 nmol/L,T4:57.9～140.3 nmol/L,TSH:0.55～4.78 μIU/mL,TRAb: 0.00～1.75 IU/L)。

1.3.2 血漿細胞因子的測定

應用乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium salt, EDTA-K2)抗凝采血管采集兩組患者的清晨空腹靜脈血標本。1 000g離心10 min, 取分離出的血漿進行細胞因子檢測。全血充分混勻后在全自動血液分析儀上機,采用細胞因子檢測試劑盒(CytoFLEX:貝克曼庫爾特公司,美國)、多重微球流式免疫熒光發光法檢測12種血漿細胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、IFN-α、IFN-γ、TNF-α)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組患者基本臨床特征比較

本研究對14例活動期及13例非活動期GO患者的臨床資料進行了對比分析,結果顯示,兩組患者在年齡、性別、腎功能(尿素氮及肌酐)、肝功能(丙氨酸氨基轉移酶及門冬氨酸氨基轉移酶)及甲狀腺功能水平方面,差異均無統計學意義(P>0.05)。活動期GO組患者的TRAb濃度明顯高于非活動期組患者,差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 活動期及非活動期GO患者的一般臨床特征比較Tab.1 Baseline characteristics of patients with inactive and active GO

2.2 活動期與非活動期GO患者9種血漿白細胞介素濃度比較

兩組患者血漿9種白細胞介素濃度比較結果顯示,與非活動期相比,活動期患者的血漿IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17濃度明顯升高,組間差異均有統計學意義(P<0.05),其余3種白細胞介素(IL-2、IL-6及IL-12P70)濃度組間差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 活動期與非活動期GO患者血漿白細胞介素濃度Fig.1 Levels of interleukins in active and inactive GO patients

2.3 活動期與非活動期GO患者3種細胞因子濃度比較

兩組患者的血漿IFN-α、IFN-γ及TNF-α比較結果顯示,與非活動期相比,活動期患者的TNF-α及IFN-γ濃度顯著升高,組間差異均有統計學意義(P<0.05),而兩組患者血漿 IFN-α濃度差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 活動期與非活動期GO患者血漿TNF-α、IFN-α、IFN-γ濃度Fig.2 Levels of TNF-α, IFN-α and IFN-γ in active and inactive GO patients

2.4 血漿細胞因子與GO患者CAS評分的相關性分析

血漿細胞因子與CAS評分相關性分析結果表明,IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α與CAS評分呈現顯著正相關(P<0.05)(表2)。

表2 血漿細胞因子與GO患者CAS評分的相關性Tab.2 Correlation between cytokines and CAS scores in patients with GO

2.5 活動期的單因素Logistic回歸分析

考慮到樣本量較小,對活動期與非活動期組間顯著的指標,包括TRAb、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10和IL-17進行單因素Logistic回歸分析。結果顯示IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高會增加活動期風險(表3)。

表3 活動期的單因素Logistic回歸分析Tab.3 Single factor Logistic regression analysis

3 討論

GO是一種可威脅視力的自身免疫性疾病,臨床表現為眼球突出、復視或斜視,嚴重者可能會有視神經受壓及角膜潰瘍,甚至導致失明。在臨床工作中,內分泌醫師根據疾病的活動性,采取不同的治療措施:如GO處于活動期階段,患者可能接受糖皮質激素或免疫抑制劑等治療抑制免疫反應;在疾病非活動期,醫生將更多選擇矯正手術等改善患者的斜視及復視。目前臨床上活動性評價受到患者自身和醫師工作經驗等主觀性因素的影響,因此尋找合適的客觀性生物標志物來評價GO的活動性尤為重要。細胞因子在機體免疫調節及宿主防御等機制中扮演重要角色,例如IL-6廣泛表達于單核/巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞及成纖維細胞中[7-8],IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及IL-17主要由淋巴細胞分泌[9-10],IL-1β、IL-8及IL-12主要由單核/巨噬細胞分泌[11],IFN-α及IFN-γ作為IFN家族成員代表由淋巴細胞及巨噬細胞等分泌[12-13]。是否能夠找到與GO活動度密切相關的細胞因子是本文研究目的。在本文研究中,納入了初始治療的活動期及非活動期GO患者,這兩組患者在甲狀腺功能上無明顯差異。本研究結果顯示,活動期GO患者的IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17濃度明顯高于非活動期組,TNF-α及IFN-γ濃度明顯升高,兩組濃度差異均有統計學意義,預示這8種細胞因子可能是GO相關細胞因子。進一步單因素Logistic回歸分析結果顯示IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高會增加活動期風險, 提示該四種因子有可能作為評判GO活動性的指標。

在GO患者中白細胞介素的濃度變化方面,Kishazi等[14]發現GO患者中IL-10、IL-12P70、IL-13、IL-6和TNF-α濃度明顯高于健康受試者, 而活動期GO患者中的IL-13、IL-6和TNF-α濃度顯著升高;Song等[15]發現,GO患者淚液中IL-12P70、IL-1β、IL-2、IL-21及IL-6等13種蛋白濃度顯著升高,而白介素1可溶性受體Ⅰ及IL-13等蛋白濃度下調。本文研究發現,在上調的細胞因子中,IL-17濃度在活動期及非活動組中差異最為明顯,并且與臨床活動度評分具有正相關性。IL-17因子是由分化決定族抗原4(cluster of differentiation 4,CD4) T細胞亞群中輔助性T 細胞17(T helper cell 17, Th17)細胞分泌,目前已經證明可能在自體免疫疾病的發生發展中發揮著著重要角色[16]。IL-17作為促炎癥因子可誘導靶細胞產生趨化因子和增加集落刺激因子[17]。研究[18-19]表明,血清中IL-17濃度在自身免疫性疾病(包括系統性紅斑狼瘡及類風濕性關節炎)中高表達,而且血清中IL-17滴度與病情嚴重程度具有正相關性。研究[20-21]表明,活動期GO患者進行糖皮質激素治療伴隨IL-17濃度的顯著下降,這提示IL-17在GO發病及轉歸中的重要作用,可作為評價GO病情活動度的指標之一。

綜上所述,活動期GO患者血漿中IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17濃度明顯高于非活動期組, 其中IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高會增加活動期風險。但在本項研究中,課題組未對GO患者治療前后的細胞因子濃度進行研究,無法明確治療過程中臨床活動度的變化與細胞因子的關聯性。并且此研究樣本量小,缺乏長期隨訪跟蹤研究,未能排除藥物對細胞因子的影響,在后續的研究中需要擴大樣本量,對GO患者治療前后的細胞因子進行分析,并設置治療后不同療效組,分析不同治療方案的治療效果與細胞因子的相關性,進一步探討細胞因子與GO的關系。鑒于此,分析不同的細胞因子在GO患者中的表達情況及其對GO的影響可為GO的臨床治療提供新的思路及免疫治療新的靶點,以便尋找新的安全有效的治療方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明謝榮榮:提出研究思路,設計研究方案,數據分析,撰寫論文;史婷婷,信中: 采集數據;曹曦:分析數據;楊金奎:審定論文,總體把關。