SiO2-Pickering乳液佐劑增強沙眼衣原體Pgp3蛋白免疫效果

史可靚, 方春霞, 趙蘭華, 周輝, 李忠玉

1.南華大學衡陽醫學院病原生物學研究所 特殊病原體防控湖南省重點實驗室,湖南衡陽 421001;2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院,湖南長沙 410007

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是一類在細胞內寄生的微生物,感染不同人體部位可誘發不同疾病,長期反復使用抗生素治療易產生耐藥性[1-2],因此,衣原體疫苗可能是有效預防衣原體感染的關鍵,但由于衣原體血清型和抗原構象復雜,目前還沒有臨床應用疫苗的報道。

Pgp3是由Ct質粒編碼的唯一能分泌到宿主細胞胞質的蛋白[3],是Ct調控宿主細胞通路維持生存的關鍵毒力因子。Pgp3能誘導機體產生高效價抗體,具有良好免疫原性[4],但單獨的Pgp3蛋白疫苗不足以產生高效的免疫應答和免疫保護以快速清除Ct感染[5],因此尋找安全、有效的佐劑來增強其免疫效果尤為重要。Pickering乳液是采用固體粒子穩定油水體系的一種新型乳液,不易受pH值、溫度、鹽含量及油相組成的影響,具有良好穩定性[6]。二氧化硅(SiO2)因顆粒直徑可控、安全、穩定等諸多優勢而成為最常用于制備Pickering乳液的固體粒子。Pickering乳液能通過控制對抗原蛋白的裝載與吸附來有效增強免疫效果[7]。本研究通過優化構建安全穩定的SiO2Pickering(SPE)乳液佐劑,將SPE乳液佐劑聯合Ct Pgp3蛋白免疫BABL/c小鼠,探討SPE乳液佐劑對Pgp3蛋白的免疫增強作用及其機制,為Ct感染性疾病的預防與治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料

BABL/c雌性小鼠(4周齡,SPF級)購于斯萊克景達實驗動物有限公司;BCA蛋白測定試劑盒購于康為世紀公司;ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)均購于Biolegend公司;CCK-8試劑盒購于DOJINDO Molecular公司;pGEX-6p-1/Pgp3重組質粒轉化菌E.coli XL1-blue為本課題組保存。

1.2 SPE乳液制備和表征分析

為了制備出穩定、液滴直徑小而均一的Pickering乳液,本實驗從水油比、SiO2質量濃度、超聲功率這幾方面進行優化。將SiO2納米顆粒與去離子水混合,攪拌至粉末完全溶解,配置不同質量濃度(1、5、10 g/L)SiO2水相。吸取適量SiO2水相與液體石蠟(liquid paraffin,LP)混合,不同水油體積比分別為10∶1、10∶2、10∶4。設置不同功率(67～670 W)超聲制備SPE乳液佐劑。SPE乳液靜置8～12 h后,光學普通顯微鏡下觀察乳液微觀結構,Nanomeasure軟件分析液滴平均粒徑;SPE乳液用去離子水稀釋100倍后,取1.5 mL加入到激光粒度分析儀樣品池中,測定乳液顆粒平均粒徑以及聚合物分散性指數(polymer dispersibility index,PDI)。

1.3 Pgp3蛋白表達純化及鑒定

將pGEX-6p/Pgp3轉化菌株接種于LB固體培養基(Amp抗性),37 ℃培養過夜,挑取單個菌落加入液體培養基37 ℃、220 r/min培養12 h,取適量菌液加入600 mL液體培養基(Amp抗性)37 ℃、220 r/min擴大培養4 h,隨后加入IPTG(終濃度0.2 mmol/L)于37 ℃、180 r/min誘導培養6 h,離心超聲裂解菌液后收集上清,樹脂純化后加入PreScission Protease切除GST標簽,離心收集上清Pgp3蛋白。使用BCA法測定蛋白水平,并使用SDS-PAGE凝膠電泳及Western blotting分析鑒定。

1.4 BALB/c小鼠免疫接種

選取4周齡BABL/c雌性小鼠30只,隨機均分成SPE+Pgp3組、Pgp3組和PBS組。SPE+Pgp3組采用SPE乳液佐劑與50 μg Pgp3蛋白混合后免疫;Pgp3組采用50 μg Pgp3蛋白單獨免疫;PBS組則注射50 μg PBS作為對照。3組均采取皮下注射方式,于0、2、4周分別進行3次免疫。

1.5 抗原特異性抗體的檢測

分別于0、2、4、6周小鼠尾靜脈采血,4 ℃靜置過夜,5 000 r/min離心10 min,收集血清-20 ℃儲存備用。用0.05 mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋Pgp3蛋白至100 mg/L,在96孔ELISA板中每孔加入100 μL,4 ℃包被過夜;使用PBST洗滌后每孔加入250 μL含5%脫脂奶粉的封閉液,37 ℃封閉2 h;洗滌封閉液后每孔加入100 μL倍比稀釋的小鼠血清進行一抗孵育,同時設置陰性對照組和空白組,37 ℃孵育2 h;洗滌5次后每孔加入100 μL按比例稀釋HRP標記羊抗鼠IgG(1∶5 000)、IgG1(1∶5 000)、IgG2a(1∶5 000),37 ℃孵育1 h;孵育洗滌完成后加入TMB顯色液避光顯色15 min,加入2 mmol/L H2SO4(50 μL/孔)終止反應。使用酶標儀檢測各孔波長450 nm處光密度值(optical density,OD),比較IgG及其亞類IgG1、IgG2a抗體滴度。

1.6 淋巴細胞增殖的檢測

收集小鼠6周時脾淋巴細胞,加入2×106個/mL 200 μL脾淋巴細胞懸液至96孔培養板,每孔加入10 μg Pgp3蛋白刺激淋巴細胞,同時設置刺激組和未刺激組,37 ℃、5%CO2培養48 h,每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續培養4 h,使用酶標儀檢測450 nm處OD值,并計算刺激指數(stimulation index,SI),SI=(OD刺激組-OD空白組)/(OD未刺激組-OD空白組)。

1.7 細胞因子的檢測

收集6周小鼠脾淋巴細胞,加入1 mL 2×106個/mL脾淋巴細胞懸液至24孔培養板,每孔加入10 μg Pgp3蛋白刺激淋巴細胞,充分混勻,37 ℃、5%CO2培養48 h,刺激完成后,收集培養液上清液,根據試劑盒說明書檢測脾淋巴細胞上清IFN-γ、IL-4水平。

將6周時的脾淋巴細胞接種至24孔培養板,每孔加入1 μL刺激劑,刺激5 h后收集細胞,800 g離心5 min后棄去上清,加入0.5 μL Fc阻斷劑孵育10 min后,加入表面染色抗體(CD4-FITC、CD8-Percp Cy5.5)冰上孵育40 min;每個樣本中加入100 μL IC Fixation Buffer于冰上固定40 min;再加入800 μL破膜液,800 g離心7 min,重復破膜1次,棄上清后按說明書加入胞內抗體(IFN-γ-APC、IL-4-PE),避光孵育60 min,加入300 μL PBS重懸進行流式細胞術檢測脾淋巴細胞上清IFN-γ、IL-4水平。

1.8 統計學分析

采用Graphpad Prism 9軟件進行數據處理和分析,組間比較采用Student’st檢驗和單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SPE乳液的優化與表征

SiO2顆粒能穩定LP油相,外觀呈細膩流體狀;光學顯微鏡下SiO2乳液粒徑小而均一,且10∶2水油比時顆粒更為均勻。隨超聲功率增加,乳液粒徑逐漸減小且均一,當超聲功率達675 W時,粒徑反而增大且不均勻。隨SiO2質量濃度1、5、10 g/L的增大,形成的乳液粒徑增大且均勻性降低。根據以上結果,選擇SPE最優制備條件為超聲功率337 W、水油比10∶2、SiO2質量濃度1 g/L,最優條件下SPE粒徑為(300.12±44.26) nm,PDI為0.33±0.12(圖1)。

圖1 SPE乳液的優化與表征

2.2 Pgp3蛋白鑒定結果

如圖2A所示,26 kD處出現與Pgp3蛋白分子量相符合的條帶;Western blotting驗證,26 kD處出現明顯條帶(圖2B)。

圖2 Pgp3蛋白的純化和鑒定A為SDS-PAGE鑒定;B為Western blotting鑒定。M為Marker;1和3為GST-Pgp3融合蛋白剪切純化后產物;2為對照。

2.3 各組抗原特異性抗體的比較

PBS組未檢測出特異性抗體,其他各組均隨免疫次數的增多,小鼠血清抗體滴度逐漸升高;6周時,SPE+Pgp3組IgG總抗體、亞類IgG1、IgG2a的滴度高于Pgp3組(P<0.05;圖3),SPE+Pgp3組、Pgp3組IgG2a/IgG1分別為1.22和1.15,其中SPE+Pgp3組的IgG2a升高更為顯著,提示SPE乳液佐劑能提高Pgp3的特異性抗體水平,且SPE+Pgp3能誘導特異性Th1型免疫反應。

圖3 各組免疫后小鼠血清IgG總抗體及亞類抗體水平的比較a為P<0.05,與Pgp3組比較。

2.4 各組脾淋巴細胞增殖的比較

6周時,SPE+Pgp3組SI(3.67±0.24)和Pgp3組SI(2.16±0.11)均明顯高于PBS組(1.05±0.14)(P<0.05),且SPE+Pgp3組高于Pgp3組(P<0.05),說明SPE乳液佐劑能有效促進Pgp3蛋白特異性淋巴細胞增殖。

2.5 各組細胞因子的比較

SPE+Pgp3組和Pgp3組IFN-γ含量明顯高于PBS組,且SPE+Pgp3組高于Pgp3組(P<0.001;圖4),提示SPE乳液佐劑能有效促進細胞因子IFN-γ分泌。各組經刺激后僅檢測到低水平IL-4(圖4)。

圖4 各組小鼠免疫后脾細胞上清細胞因子水平的比較a為P<0.001,與PBS組比較;b為P<0.001,與Pgp3組比較。

流式細胞術結果顯示,Pgp3組、SPE+Pgp3組CD4+T細胞和CD8+T細胞的IFN-γ水平明顯高于PBS組,且SPE+Pgp3組高于Pgp3組(P<0.05;圖5),提示SPE乳液佐劑能有效促進CD4+和CD8+T細胞IFN-γ的分泌。

圖5 小鼠免疫后流式細胞術檢測脾細胞細胞因子水平a為P<0.05,與PBS組比較;b為P<0.05,與Pgp3組比較。

3 討 論

Pgp3蛋白是衣原體致病的重要毒力因子,且具有較強的免疫原性[8],然而單獨的蛋白抗原難以實現完全高效的細胞和體液免疫反應,需要合適的佐劑輔助增強其免疫效果。本實驗將使用優化制備的SPE乳液作為佐劑,聯合Pgp3蛋白制備成疫苗制劑,通過建立小鼠生殖道衣原體感染模型,探討SPE乳液的免疫增強效果及機制,為Ct感染性疾病的防治提供實驗依據。

Pickering乳液是指以固體粒子代替了表面活性劑分子來穩定的乳液[9],如鋁佐劑、纖維素、聚苯乙烯[10]、殼聚糖、SiO2[11]等,其固體顆粒在水油界面上自組裝,并在芯層固化后形成球形外殼。與傳統乳液相比,Pickering乳液具有較高的安全性以及穩定性[12-13]。而一種理想的顆粒穩定劑應該具有較高的安全特性、容易獲取、來源豐富及具有疏水性等優點[14],這些對于制備穩定安全的Pikering乳液非常重要。SiO2作為一種安全低毒且來源豐富的無機金屬顆粒,具有強大的吸附能力且易溶于水,由于比表面積大,表面吸附能力強,經常用于吸附與分離[15],但由于本身特性難以收集,將其制備成Pickering乳液后可以更好地連接SiO2納米粒子并使其穩定。因此,本實驗選用了SiO2作為穩定劑,并使用不同條件制備SPE乳液以獲得最優Pickering乳劑配方。

已有研究表明,粒徑較小的納米顆粒較粒徑大的納米顆粒能更快進入引流淋巴結,有利于適應性免疫反應的形成[16-17]。因此,合理調節納米顆粒的粒徑直徑及其在注射部位停留的時間是優化制備Pickering乳液的關鍵。除此之外,Pickering乳液佐劑的水油比、納米顆粒質量濃度以及超聲功率也是制備出穩定均一乳液佐劑的重要參數[7]。本實驗經上述一系列條件優化后的SPE乳液粒徑小且均勻,能形成穩定的顆粒及水油相,是一種有潛力的蛋白裝載和呈遞的候選佐劑。優化后的SPE乳液佐劑可通過有效增強Pgp3抗原的吸收、促進細胞因子和趨化因子的增強及釋放,有效募集單核細胞和粒細胞至肌肉注射部位,促進其被遷移至引流淋巴結[18-20],以輔助Pgp3蛋白實現高效細胞免疫及體液免疫。本實驗使用優化后的SPE乳液佐劑聯合Pgp3蛋白制備成疫苗制劑,以進一步增強Pgp3蛋白的免疫反應水平。

為觀察聯合疫苗制劑SPE+Pgp3的體液免疫水平,本實驗采用了ELISA間接法檢測各組特異性抗體的滴度,結果發現,隨著免疫次數的增加,Pgp3組和SPE+Pgp3組小鼠抗體滴度均逐漸升高,且SPE+Pgp3組抗體滴度顯著高于Pgp3組,說明SPE乳液佐劑能有效提高Pgp3蛋白的體液免疫水平?？贵w亞型結果顯示,SPE+Pgp3組IgG1與IgG2a均升高,且以IgG2a升高為主。IgG2a的產生高度依賴于Th1型[21-22]細胞分泌的IFN-γ和IL-2[23-24],而IgG1的產生則主要依賴于Th2細胞產生的IL-4,本實驗聯合疫苗制劑SPE+Pgp3組IgG2a的相對高水平說明其誘導的免疫反應偏向于Th1型。

淋巴細胞增殖反應是評估細胞免疫反應的重要指標,也能在一定程度上反映機體特異性細胞免疫功能,本實驗采用CCK-8法檢測各組脾淋巴細胞SI發現,與Pgp3組相比,SPE+Pgp3組脾淋巴細胞SI明顯升高,說明SPE乳液佐劑能有效促進Pgp3蛋白特異性淋巴細胞的增殖。而抗衣原體感染的細胞免疫則主要依賴于CD4+Th1細胞反應[25-26],其中IFN-γ[27-28]為抗衣原體感染的關鍵因子。IFN-γ能控制機體內衣原體的載量,并能促進一氧化氮合酶的合成、超氧化物歧化酶以及色氨酸的催化,這些機制可能與機體殺滅衣原體相關[29]。研究證實,在機體感染過程中,CD8+T細胞同樣會受到刺激并分泌IFN-γ,且CD8+T細胞能介導鼻內免疫后對Ct生殖道的跨黏膜保護性免疫[30]。本實驗將脾淋巴細胞經特異性蛋白抗原刺激后,培養上清結果顯示,Pgp3組與SPE+Pgp3組均產生較高水平IFN-γ,但SPE+Pgp3組產生的IFN-γ顯著高于Pgp3組,說明SPE乳液佐劑能有效促進Pgp3蛋白進一步產生IFN-γ,增強機體細胞免疫應答水平;各組淋巴細胞培養上清中的IL-4水平較低,高水平的IFN-γ與低水平的IL-4進一步提示聯合疫苗制劑誘導的免疫反應偏向于Th1型。為了進一步分析細胞因子IFN-γ的具體細胞來源,本實驗將脾淋巴細胞經由BFA和cocktail刺激后,檢測分析由CD4+T細胞與CD8+T細胞分泌的IFN-γ,結果顯示,與PBS組相比,各組CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌的IFN-γ均明顯升高,且SPE+Pgp3組顯著高于Pgp3組,提示SPE乳液佐劑能有效促進CD4+與CD8+T細胞分泌IFN-γ。

總而言之,本實驗優化制備的SPE乳液佐劑顯著增強了Pgp3蛋白的細胞免疫應答及體液免疫應答,為Ct疫苗的研制提供了一種潛在的候選佐劑;但該疫苗制劑能否通過增強Pgp3蛋白疫苗的免疫反應以達到預防Ct感染防治的目的,還需要進一步實驗來驗證。