黃芩苷通過激活JNK/p38 MAPK通路誘導ALL Reh細胞凋亡

肖李, 王廣, 練高建, 李程悅, 龔慧芳, 王俊涵, 蘇澤紅

南華大學衡陽醫學院 1.生物化學與分子生物學研究所,2.實驗動物學部,湖南衡陽 421001

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是導致兒童死亡的常見惡性腫瘤之一,其治療主要采用誘導腫瘤細胞凋亡。細胞凋亡也稱為細胞程序性死亡,凋亡時其信號匯集在細胞線粒體膜上,使膜表面促凋亡蛋白Bax發生構象改變而被激活,活化的Bax促使線粒體膜結構與功能發生改變,線粒體內可溶性血紅素蛋白細胞色素C、核酸內切酶G、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及其他線粒體膜間隙蛋白被釋放至胞質,激活下游Caspase-3、Caspase-7,從而引發細胞凋亡[1]。因此維持線粒體膜功能(mitochondrial membrane function,MMP)是抑制細胞凋亡的重要途徑。c-Jun氨基蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號家族通路中兩條至關重要的通路。MAPK通路調控細胞生長、增殖、分化、應激、遷移和死亡[2]。黃芩苷是中草藥黃芩根部的多酚提取物,具有抗氧化、抗增殖及抗腫瘤等多種生物活性[3],但其對于ALL Reh細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制尚未可知,基于此,本文對此進行了研究,旨在為黃芩苷應用于ALL臨床治療提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器和細胞

黃芩苷購自索萊寶公司(Solarbio);AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和線粒體膜定位檢測試劑盒(JC-1)購自江蘇凱基生物公司;ROS檢測試劑盒、一步法TUNEL凋亡檢測試劑盒和細胞核DAPI染色液購自上海碧云天生物技術公司;多功能細胞成像儀購自美國BioTek公司;流式細胞儀購自美國BD公司;化學發光成像系統購自上海天能科技有限公司;高速冷凍離心機和EVOSTMM5000成像系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

ALL細胞株Reh購自ATCC細胞庫,Reh細胞株在RPMI1640培養基(含10%及1%青-鏈霉素雙抗)37 ℃、5%CO2培養。

1.2 MTS法測定Reh細胞增殖

將Reh細胞以3×104個/孔接種于96孔細胞培養板培養24 h,用10、20、40、60、80、100 mg/L黃芩苷處理細胞,將細胞與20 μL MTS溶液共孵育4 h,490 nm波長處測定每孔光密度(optical density,OD),計算細胞存活率。設立對照組(Reh細胞)和DMSO組(0.1%DMSO+Reh細胞)。

1.3 流式細胞術和免疫熒光TUNEL染色法檢測細胞凋亡

將Reh細胞以5×105個/孔接種于12孔細胞培養板中培養24 h,用20、40 mg/L黃芩苷處理細胞,收集細胞。重懸浮細胞沉淀后,依次加入Annexin V-FITC和PI染色液,流式細胞儀測定細胞凋亡情況。免疫染色固定液固定后,TUNEL染色液染色1.5～2.0 h;DAPI染色液染色5 min后,成像系統觀察細胞凋亡情況。設立對照組(Reh細胞)。

1.4 DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS

將Reh細胞以5×105個/孔接種于12孔細胞培養板中培養24 h,用20、40 mg/L黃芩苷、20 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC、40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC處理細胞,收獲細胞。按照碧云天活性氧ROS檢測試劑盒說明書稀釋DCFH-DA探針,染色,流式細胞儀測定細胞內ROS水平。設立對照組(Reh細胞)。

1.5 JC-1熒光探針檢測細胞內MMP

同1.4分組,收獲細胞,加入JC-1染色工作液孵育染色后,流式細胞儀檢測細胞內MMP。

1.6 Western blotting檢測蛋白水平

將Reh細胞以1×106/孔接種于12孔細胞培養板中培養24 h,用20、40 mg/L黃芩苷、5 mmol/L NAC、40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC處理細胞,RIPA buffer裂解細胞,提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶后轉膜,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,化學發光成像系統顯色。設立對照組(Reh細胞)。

1.7 統計分析

2 結 果

2.1 黃芩苷對Reh細胞增殖的影響

黃芩苷處理Reh細胞后能顯著抑制細胞增殖,IC50為20 mg/L(P<0.01;圖1)。后續實驗均選擇20、40 mg/L作為黃芩苷干預質量濃度。

圖1 黃芩苷對Reh細胞增殖的影響a為P<0.05,b為P<0.01,c為P<0.001,與對照組比較。

2.2 黃芩苷誘導Reh細胞凋亡

黃芩苷處理Reh細胞24 h后,20 mg/L和40 mg/L黃芩苷組細胞凋亡率分別為32.1%和85.53%。鏡下觀察經黃芩苷處理后,凋亡的Reh細胞數量明顯增多,細胞膜皺縮變形,核內染色質凝聚,細胞核碎裂(圖2A);細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin蛋白表達顯著降低,而促凋亡蛋白Bax、Cleaved-Caspase-3/7及Cleaved-多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表達顯著升高(P<0.05,P<0.01;圖2B)。以上提示,黃芩苷誘導Reh細胞凋亡。

圖2 黃芩苷誘導Reh細胞凋亡A為TUNEL染色結果; B為Western blotting結果。a為P<0.05,b為P<0.01,與對照組比較。

2.3 黃芩苷通過損傷MMP升高胞內ROS水平,從而誘導Reh細胞凋亡

黃芩苷誘導細胞MMP受損,ROS水平顯著升高;黃芩苷聯合NAC處理Reh細胞后,細胞內ROS水平、細胞凋亡率顯著降低,細胞增殖明顯恢復(P<0.01,P<0.05;圖3)。以上結果表明,黃芩苷可通過損傷MMP提高胞質內ROS水平,從而誘導Reh細胞凋亡。

圖3 黃芩苷損傷MMP從而升高胞內線粒體ROS,誘導Reh細胞凋亡1為對照組;2為20 mg/L黃芩苷;3為40 mg/L黃芩苷;4為20 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC;5為40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC。a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.01,與同質量濃度黃芩苷組比較。

2.4 黃芩苷上調JNK/p38 MAPK通路誘導Reh細胞凋亡

JNK/p38 MAPK作為ROS下游靶蛋白[4-5],黃芩苷升高Reh細胞內ROS水平后明顯激活了JNK/p38 MAPK通路;而清除ROS則顯著抑制了JNK/p38 MAPK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的活化,而Survivin表達水平得以恢復(P<0.01,P<0.05;圖4)。以上提示,黃芩苷通過升高胞內ROS水平激活JNK/p38 MAPK通路,從而誘導Reh細胞凋亡。

圖4 黃芩苷激活JNK/p38 MAPK通路誘導Reh細胞凋亡a為P<0.05,與對照組比較;b為P<0.01,與40 mg/L黃芩苷+5 mmol/L NAC組比較。

3 討 論

ALL是一種異質性血液系統惡性腫瘤,其主要致病機理是未發育成熟的淋巴母細胞在患者骨髓、外周血及其他外周器官異常增殖,導致血液中淋巴母細胞數量異常增多,外周器官病變。關于ALL治療主要以化療為主,常用的ALL化療藥物包括強的松龍、長春新堿、阿霉素、柔紅霉素和I-天冬酰胺酶等[6]。然而,化療常給患者帶來較大不良反應,且在化療治療ALL進程中易產生對化療藥物的耐藥性,亟需發掘新的不良反應較小的化療藥物。細胞凋亡主要是由機體內部或受到外部刺激引發,參與介導凋亡的途徑有3類,一類是內質網應激誘導途徑;一類是細胞表面信號介導轉導途徑;另一類是線粒體介導途徑[7]。細胞凋亡歸屬于細胞正常性死亡,有助于清除體內衰老、損傷和多余的細胞,且對生物體內生理機能、免疫穩態維持和癌癥防治至關重要。

黃芩苷是中草藥黃芩根部多酚提取物,其親脂性比較高,有助于提高穿透細胞的能力和有利于機體快速吸收;黃芩苷能夠通過不同機制誘導細胞凋亡來抑制多種腫瘤細胞生長,比如可通過升高乳腺癌細胞內ROS水平在體內外抑制腫瘤生長和轉移;可通過促進ROS產生、損傷MMP來抑制骨肉瘤和骨髓瘤細胞生長;也可通過增加促凋亡蛋白Bax的表達和下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達抑制肺癌細胞、鼻咽癌細胞、肝癌細胞以及結直腸癌細胞的生長[8-12]。

本研究發現,首先MTS結果表明黃芩苷抑制Reh細胞生長,隨后流式細胞術、免疫熒光和Western blotting的結果均表明黃芩苷處理后Reh細胞發生凋亡、ROS水平上調以及MMP受到抑制。以上提示,黃芩苷可有效抑制Reh細胞增殖,并呈一定劑量依賴性;且黃芩苷是通過促使Reh細胞ROS產生增加來誘導細胞發生凋亡。

JNK/p38 MAPK屬于MAPK家族,參與細胞增殖、分化和死亡等過程。例如,JNK/p38 MAPK也分別參與促進神經元細胞、少突膠質細胞祖細胞和神經干細胞增殖;JNK/p38 MAPK能參與誘導肺上皮-間質細胞的分化[13-14]。此外,在惡性間皮瘤細胞中,沒食子酸通過激活p38通路誘導細胞凋亡來發揮抗腫瘤效果。蟲草素通過活化JNK/p38 MAPK來抑制人結腸癌細胞增殖和促進細胞凋亡。瑞非尼通過活化JNK/p38 MAPK通路抑制肺癌的生長[15]。因此,靶向激活JNK/p38 MAPK可能為研發新的ALL化療藥物提供參考。本研究Western blotting結果表明,黃芩苷上調了磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表達,而NAC和黃芩苷合用后則下調了磷酸化JNK和磷酸化p38蛋白表達,且抗凋亡蛋白Survivin表達水平恢復。以上提示,黃芩苷經激活Reh細胞內JNK/p38 MAPK通路,促進細胞發生凋亡;而清除ROS后則可抑制JNK/p38 MAPK蛋白磷酸化,細胞凋亡得以抑制,表明黃芩苷升高胞內ROS水平來激活Reh細胞內JNK/p38 MAPK通路誘導細胞凋亡。

綜上所述,黃芩苷經損傷Reh細胞MMP來升高胞內ROS水平,并靶向激活JNK/p38 MAPK通路,誘導Reh細胞凋亡。這些結果為進一步深入研究ALL發病機制及防治提供了一定的理論依據。