過表達miR-199-3p/5p誘導胰腺癌細胞BxPC-3、Panc-1鐵死亡的作用機制

黎文濤, 伍小瓊, 馮志鵬, 王正根

1.南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院消化內科,湖南衡陽 421001;2.湖南師范大學附屬岳陽醫院消化內科,湖南岳陽 414000

胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)是惡性程度極高的腫瘤[1]。作為預后極差的消化系統腫瘤,胰腺癌具有早期診斷困難、手術切除率低、術后易復發、易轉移等臨床特點,總體5年生存率不足8%,臨床診治極具挑戰性[2]。鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質過氧化、活性氧過量產生所致的細胞死亡類型。目前研究發現,鐵死亡參與了胰腺癌的發生發展過程[3]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性非編碼RNA,廣泛參與基因轉錄后調控活動,通過調控靶基因表達,參與腫瘤的發生發展,并參與鐵死亡的調控[4]。本研究探討miR-199過表達對胰腺癌細胞BxPC-3和Panc-1鐵死亡的作用及其調控機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人胰腺癌細胞株BxPC-3和Panc-1(中國科學院上海生命科學院生化細胞所),轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國),DMEM培養基(Sigma,美國),雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Qiagen,美國),TRIzol熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific,美國),miRNA反轉錄試劑盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker(康為世紀,中國),谷胱甘肽(glutathione,GSH)(北京索萊寶,中國),脂質過氧化物(lipid peroxidation,LPO)(武漢伊萊瑞特,中國),Fe2+比色法檢測試劑盒(廣州沛瑜,中國),熒光素酶報告載體野生型(wild type,WT)-SLC7A11、突變型(mutant type,MT)-SLC7A11、WT-BTRC、MT-BTRC由上海吉瑪基因公司構建。0.45 μm過濾膜(Millipore,美國),多功能酶標分析儀(匯松,中國),電泳儀(六一,中國),SCL7A11多克隆抗體(SAB#43437,美國),BTRC多克隆抗體(SAB#32369,美國),TFRC多克隆抗體(SAB#33101,美國),泛素化Ubiquitin多克隆抗體(武漢三鷹#10201-2-AP,中國),β-actin單克隆內參抗體(abcam#ab8226,美國),hsa-miR-199-3p模擬物(5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′)、hsa-miR-199-3p抑制物(5′-UAACCAAUGUGCAGACUACUGU-3′)、hsa-miR-199-5p模擬物(5′-CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC-3′)、hsa-miR-199-5p抑制物(5′-GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG-3′)(上海吉瑪基因,中國)。

1.2 細胞培養及瞬時轉染miR-199模擬物和抑制物

將細胞1×105個/mL接種于培養瓶中,加入10%血清的DMEM培養基,放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱內培養。細胞進入對數生長期后,0.25%胰蛋白酶消化2～3 min,PBS洗滌細胞2次,再傳代培養。加入轉染試劑Lipofectamine 2000轉染48 h后進行后續實驗。胰腺癌細胞Panc-1和BxPC3實驗分為對照組、miR-199-3p/5p模擬物組、miR-199-3p/5p抑制物組。

1.3 qRT-PCR檢測miR-199-3p/5p的表達水平

收集細胞,用300 μL TRIzol裂解液提取總RNA。加入氯仿12 000 g,10 min低溫離心。取氯仿層加入等量的異丙醇過夜沉淀。10 min低溫離心,去除上清,用優級乙醇清洗沉淀。晾干后復溶,紫外分光光度計Nanodrop One檢測總RNA的含量和純度;按照High-Capacity cDNA反轉錄試劑盒說明書,反轉錄合成cDNA;依據SYBR Green試劑盒的說明書進行PCR擴增,以U6為內參,檢測各樣本中基因的表達水平,通過2-ΔΔCT方法計算各基因的相對含量。hsa-miR-199-3p上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGACAGTAGTCTGCACAT-3′,下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAACCAAT-3′;hsa-miR-199-5p上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTTAGACTAT-3′,下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAACAGAT-3′;U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 Western blotting檢測蛋白水平

收集細胞,加入500 μL RIPA蛋白裂解液,12 000 g離心8 min,取上清液,用BCA蛋白試劑盒對樣品中總蛋白質進行定量。加入適量蛋白上樣緩沖液,放置于100 ℃干式恒溫儀加熱8 min,使蛋白充分變性,置于-80 ℃冰箱保存備用。運用SDS-PAGE凝膠電泳方法分離蛋白質樣品,將其轉移到PVDF膜上,4 ℃過夜孵育一抗,用辣根過氧化物酶標記法檢測SLCTA11、BTRC、TFRC蛋白質表達水平。掃描后應用ImageJ軟件分析目標條帶的灰度值。

1.5 試劑盒檢測胰腺癌細胞中GSH、Fe2+、LPO水平

收集細胞,加入裂解液裂解細胞,離心取上清備用。分別參照GSH、Fe2+、LPO檢測試劑盒說明書進行樣品溶液的配制及檢測。

1.6 免疫共沉淀檢測BTRC對TFRC泛素化的調節

在Panc-1和BxPC3細胞中分別轉染過表達的BTRC(OE-BTRC組:NM_033637.4→Homo sapiens,Gene ID:8945,CDS:17—1834,1818 bp)和敲除的BTRC(KD-BTRC組,siRNA:5′-CCCAGGGACUGGCGCACUCdTdT-3′),對照組細胞不做任何處理。48 h后收集細胞,加入適量含蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩沖液,冰上裂解30 min,離心30 min后取上清;加入1 μg相應的TFRC抗體,緩慢搖晃后4 ℃孵育過夜。取10 μL蛋白A瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3次,每次3 000 r/min離心3 min預處理,加入到和TFRC抗體孵育過夜的細胞裂解液中,緩慢搖晃后4 ℃孵育4 h,使TFRC抗體與蛋白A瓊脂糖珠偶連。免疫沉淀IP反應后,在4 ℃環境下以3 000 r/min離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液洗4次后進行Western blotting相關檢測(同時設置Input陽性對照組,即用IP前的樣品做Western blotting排除假陽性干擾)。

1.7 熒光素酶活性檢測miR-199-3p/5p與靶基因的相互作用

質粒轉染培養48 h后加入細胞裂解液,室溫下裂解15 min,移液槍反復吹打,吸取裂解產物至1.5 mL離心管中,14 000 g離心15 min,取上清。小心吸取20 μL細胞裂解上清(用細胞裂解液補至100 μL),與10 μL熒光素酶檢測工作液迅速混勻,使用酶標儀檢測雙熒光素酶報告基因活性。

PAAD細胞Panc-1、BxPC3分為陰性對照組(WT/MT空報告質粒)、miR-199-3p/5p模擬物+WT/MT組(WT/MT SLC7A11-3UTR熒光素酶報告質?；騑T/MT BTRC-3UTR熒光素酶報告質粒,miR-199-3p模擬物對應加入SLC7A11-3UTR,miR-199-5p模擬物對應加入BTRC-3UTR)。

1.8 統計學分析

采用SPSS 12.0軟件進行統計處理。計數資料采用方差分析,計量資料采用t檢驗。P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 miR-199-3p/5p在胰腺癌Panc-1和BxPC3細胞中的表達水平

與對照組比較,miR-199-3p/5p模擬物組miR-199-3p和miR-199-5p的基因表達水平均顯著上調,抑制物組顯著降低(P<0.05;圖1),提示轉染成功。

圖1 miR-199-3p/5p在胰腺癌Panc-1和BxPC3細胞中的表達水平a為P<0.05,與對照組比較。

2.2 miR-199-3p/5p調控胰腺癌細胞鐵死亡GSH、Fe2+、LPO水平

與對照組比較,miR-199-3p/5p模擬物組GSH水平降低,Fe2+、LPO水平升高;抑制物組各指標則相反(P<0.05;圖2)。

圖2 miR-199-3p/5p調控胰腺癌細胞鐵死亡相關GSH、Fe2+、LPO水平a為P<0.05,與對照組比較。

2.3 miR-199-3p/5p調控胰腺癌細胞鐵死亡相關信號通路SLC7A11、BTRC、TFRC蛋白水平

與對照組比較,miR-199-3p/5p模擬物組SLC7A11、BTRC蛋白水平降低,TFRC蛋白水平升高;miR-199-3p/5p抑制物組則相反(P<0.05;圖3)。

圖3 miR-199-3p/5p調控胰腺癌細胞鐵死亡相關信號通路SLC7A11、BTRC、TFRC蛋白水平a為P<0.05,與對照組比較。

2.4 BTRC調控TFRC泛素化水平

與對照組比較,Input中,OE-BTRC組BTRC蛋白水平顯著上調,而KD-BTRC組BTRC蛋白水平顯著降低,提示質粒構建和轉染成功。OE-BTRC組顯著降低TFRC蛋白水平,而KD-BTRC組提高TFRC本身蛋白水平。TFRC抗體IP沉淀后Western blotting檢測Ubiquitin,OE-BTRC組能夠顯著降低TFRC蛋白泛素化水平,KD-BTRC組則提高TFRC蛋白泛素化水平(P<0.05;圖4)。

圖4 BTRC調控TFRC泛素化水平1為對照組;2為OE-BTRC組;3為KD-BTRC組。a為P<0.05,與對照組比較。

2.5 雙熒光素酶報告結果

miR-199-3p與SLC7A1靶向結合,miR-199-5p與BTRC靶向結合(P<0.05;圖5A)。與陰性對照組比較,miR-199-3p模擬物+WT-SLC7A11組熒光素酶活性明顯降低(P<0.05);miR-199-5p模擬物+WT-BTRC組熒光素酶活性明顯降低(P<0.05;圖5B)。

3 討 論

miRNA與特定靶mRNA的3′-非翻譯區結合,在轉錄后調節多個基因的表達[5-6]。目前,miR-199a已被證明能抑制多種腫瘤生長,包括食管癌、肝癌和結直腸癌[7-9]。然而,關于miR-199對胰腺癌的調控作用仍未見報道。

本研究發現,胰腺癌細胞轉染miR-199模擬物和抑制物結果表明,miR-199模擬物具有抗胰腺癌作用,其機制與誘導胰腺癌細胞發生鐵死亡有關。另外,BTRC能調控TFRC的蛋白泛素化水平,抑制BTRC的表達能夠誘導TFRC的蛋白泛素化降解,提高TFRC本身蛋白水平。

迄今為止,報道的miR-199a下游靶基因包括癌基因PHLPP1、E2F3、FZD6/7、HK2和MAP3K11,在各種癌癥的發病機制中起作用[10]。SLC7A11是誘導細胞鐵死亡的關鍵蛋白[11]。SLC7A11和SLC3A2是胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體(System Xc-)的重要組成部分,其在腫瘤細胞系集中表達,表明這些細胞中的System Xc-活性可能更高。Huang等[12]利用寡核苷酸芯片發現,9株肺癌細胞株中,A549、HOP-62、NCI-H226、NCI-H322M和NCI-H460這5株細胞中SLC7A11呈高表達;其中A549中SLC7A11和SLC3A2表達量最高。miR-199分為3p和5p,在本研究中,過表達miR-199-3p靶向抑制SLC7A11的表達,可能進一步通過抑制半胱氨酸轉運進入細胞合成GSH,GSH是GPX4降解LPO的必需反應底物,當GSH合成通路受抑時,LPO積累,鐵死亡發生[13]。此外,miR-199-5p靶向抑制BTRC誘導TFRC的泛素化降解,從而提升細胞內鐵離子水平,促進LPO在胰腺癌細胞中的堆積,誘發胰腺癌細胞鐵死亡。本實驗采用雙熒光素酶報告實驗驗證了miR-199與靶基因的相互作用。

綜上所述,本實驗首先用胰腺癌細胞轉染miR-199模擬物和抑制物,結合生信分子生物學預測證實,miR-199-3p靶向抑制胰腺癌細胞中SLC7A11,進而降低GPX4表達和GSH水平;同時miR-199-5p靶向抑制胰腺癌細胞中BTRC,則能提高TFRC表達和Fe2+水平;兩條信號通路最終均可促進LPO累積,誘導胰腺癌細胞發生鐵死亡。