PEITC對NSCLC A549、H1299細胞凋亡的影響

王松柏, 曾鈞發, 王柏琦

南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院腫瘤中心,湖南衡陽 421001

肺癌根據其分化程度、形態特征和生物學特點分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。臨床上約80%的肺癌病例為NSCLC患者,目前仍無改善NSCLC患者生存率的有效措施[1]。異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)是一種人工合成單體,具有較好的抗腫瘤作用[2]。研究顯示,PEITC可抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡,且無細胞毒性[3]。本課題前期研究發現,PEITC能夠抑制肺癌細胞侵襲[4],而其調控方式尚未完全闡明。

TMPRSS4是一種重要的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,在非小細胞肺癌中高表達[5]。TFPI-2是一種絲氨酸蛋白酶特異性抑制因子,也是一種潛在的抑癌基因,能夠影響TMPRSS4表達[6]。本研究探討PEITC對NSCLC A549、H1299細胞凋亡影響的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

PEITC(LKT Laboratories公司),TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司);pcDNA3.0-TMPRSS4過表達質粒、siRNA-TFPI-2、pcDNA3.0-TMPRSS4(上海生物工程有限公司),pGL4.10-TMPRSS4真核表達質粒(漢恒生物科技有限公司),TFPI-2抗體、β-actin抗體(Cell Signaling),細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術有限公司),DNA甲基化活性檢測試劑盒(上海銳賽生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養

人非小細胞肺癌A549、H1299細胞系購于ATCC公司。培養于10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中,37 ℃、5% CO2條件下培養24 h,待細胞生長到80%時采用0、30、50 μmol/L PEITC進行后續處理,孵育結束后用于下一步研究。

1.3 MTT檢測細胞增殖

生長于96孔板中的A549或H1299細胞經PEITC處理后繼續培養24 h。隨后每孔中加入10 μL MTT試劑后再孵育4 h,隨后每孔加入150 μL二甲基亞砜,充分振蕩后在酶標儀上設定波長為490 nm處測定各孔的光密度(optical density,OD)。

1.4 實時熒光定量PCR

取上述處理后的細胞,采用TRIzol試劑提取細胞總RNA,并用反轉錄試劑將其反轉錄為cDNA,隨后加入引物對基因進行擴增。其中20 μL反應體系包括cDNA模板2 μL,2×反應Mix 10 μL,上下游引物各0.6 μL,最后用無RNA酶的去離子水補充至總體系20 μL。PCR條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性10 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40個循環。TFPI-2上游引物為5′-AGACCGGTGAGCTGGATAG-3′,下游引物為5′-GTGATGTTGTGGTGGTGCC-3′;TMPRSS4上游引物5′-GACGAGGAGCACTGTGTCAA-3′,下游引物為5′-CTTCCCACAGGCAAGACAGT-3′;GAPDH上游引物為5′-AACCCATCACCATCTTCCAG-3′,下游引物為5′-CCAGTAGACTCCACGACATAC-3′。結果以2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達水平。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達水平

細胞經PEITC處理結束后,加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白,隨后在樣本中加入蛋白上樣緩沖液后煮沸,測定蛋白含量后行SDS-PAGE。電泳結束后將其轉到硝酸纖維素膜上,并用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。充分洗膜后加入一抗,4 ℃孵育12 h,再加HRP標記的二抗,37 ℃孵育2 h,最后ECL發光、顯影。

1.6 流式細胞術檢測

收集經過上述處理后的A549、H1299細胞。PBS緩沖液清洗細胞2～3次,1 500 r/min離心5 min。加入預冷75%乙醇,于4 ℃固定4 h,1 500 r/min離心5 min棄上清,再加入400 μL溴化乙錠(50 mg/L),100 μL RNase A(100 mg/L)4 ℃避光孵育30 min后檢測細胞周期。加入100 μL結合緩沖液重懸細胞,隨后依次加入Annexin V-FITC和溴化乙淀溶液,37 ℃避光孵育后加入碘化丙啶進行染色用于流式細胞術分析。

1.7 甲基化特異性PCR

提取上述細胞DNA,純化后按照試劑盒說明提供的方法建立反應體系,其中10 μL反應體系中包括5 μL PCR Mix、2 μL特異性引物、2 μL模板DNA和1 μL無酶水。置于PCR儀上,擴增反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃ 30 s,56 ℃ 22 s,58 ℃ 32 s,35個循環。其中甲基化TFPI上游引物為5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′,下游引物為5′-ACGACCCGCTAAACAAAACG-3′;非甲基化TFPI-2上游引物為5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′,下游引物為5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。擴增結束后分別將甲基化抑制劑5-aza-dc(陽性對照)、陰性對照含等體積的RPMI 1640培養液(ctrl)、10、30、50 μmol/L PEITC PCR產物用于瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統成像。

1.8 甲基化活性分析

收集上述經PEITC處理前后的總蛋白,測定其含量后,根據試劑盒提供的步驟,將15 μg蛋白樣品加入到含有胞嘧啶DNA孔中,隨后加入捕獲抗體,顯色后10 min內在酶標儀上設置波長為450 nm,獲取各孔OD值,TFPI-2相對活性=(處理組活性OD/對照組活性OD)×100%。

1.9 熒光素酶報告實驗

采用轉染試劑將構建好的pGL4.10-TMPRSS4熒光質粒分別轉染至A549和H1299細胞中,并以pGL4.10熒光質粒作為對照,繼續培養48 h。隨后在上述細胞中加入裂解液,室溫孵育15 min。孵育完成后10 000 r/min離心10 min,取上清進行TMPRSS4熒光素酶活性測定。

1.10 siRNA-TFPI-2與pcDNA3.0-TMPRSS4轉染

siRNA沉默TFPI-2分為空白組(加入等體積培養基)、siRNA組(RNA對照)和轉染組(TFPI-2 siRNA)。將長勢良好的A549和H1299加入至6孔板中培養,隨后將siRNA-TFPI-2加入至6孔板中,孵育20 h后棄去上清,并加入新完全培養基繼續培養72 h進行傳代。50 μmol/L PEITC處理細胞48 h,Western blotting檢測細胞內TFPI-2的表達水平,以評估RNA干擾效果,所用干擾序列分別為5′-CAGCATGAGGAAACAAATCAT-3′和5′-TTGCAATGCATAAGATATAAA-3′。TMPRSS4轉染時分為空白組(加入等體積培養基)、空載體組(加入等質量pcDNA3.0質粒)和轉染組(pcDNA3.0-TMPRSS4)。在轉染前,將A549或H1299細胞接種在6孔板中培養24 h。當細胞融合度達到70%～90%時,將培養基換成無抗生素和無血清培養基,2 h后根據Lipofetamine 2000(Invitrogen)轉染試劑盒的說明進行轉染。50 μmol/L PEITC處理細胞48 h,觀察轉染效果并收集細胞進行分析。

1.11 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件分析數據。數據比較采用Student-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PEITC抑制NSCLC細胞增殖

不同濃度PEITC處理A549、H1299細胞48 h后,細胞增殖水平均顯著降低(P<0.05),其中PEITC對A549細胞和H1299的IC50值分別為48.7 μmol/L和51.6 μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度PEITC對A549、H1299細胞增殖水平的影響a為P<0.05,與0 μmol/L比較;b為P<0.05,與10 μmol/L比較;c為P<0.05,與30 μmol/L比較。

2.2 PEITC誘導NSCLC細胞周期阻滯及凋亡

流式細胞術結果顯示,不同濃度PEITC均能顯著誘導A549、H1299細胞周期改變,表現為G1期細胞比例降低,G2和S期細胞比例增高(圖2A);隨著PEITC濃度的遞增,A549細胞和H1299細胞凋亡率逐漸增高(圖2B)。

圖2 PEITC誘導A549和H1299細胞周期阻滯及凋亡A為不同濃度PEITC對A549、H1299細胞周期的影響;B為不同濃度PEITC對A549和H1299細胞凋亡的影響。

2.3 PEITC上調TFPI-2表達并抑制其甲基化

不同濃度PEITC處理細胞后,細胞內TFPI-2 mRNA及蛋白水平較未處理時顯著增高;TFPI-2甲基化酶活性降低,且當PEITC 50 μmol/L時,A549、H1299細胞中甲基化酶活性最低(圖3)。

圖3 PEITC對TFPI-2表達的影響A為TFPI-2蛋白水平;B為TFPI-2 mRNA表達水平;C為甲基化特異性PCR結果;D為甲基化酶活性。a為P<0.05,與0 μmol/L PEITC處理組同細胞比較;b為P<0.05,與10 μmol/L PEITC處理組同細胞比較;c為P<0.05,與30 μmol/L PEITC處理組同細胞比較。

2.4 PEITC抑制TMPRSS4表達

不同濃度PEITC處理細胞后,TMPRSS4表達水平均顯著降低,且呈濃度依賴性(圖4A)。熒光素酶報告實驗結果顯示,經PEITC處理后,細胞TMPRSS4熒光素酶活性均顯著降低(圖4B)。

圖4 PEITC抑制TMPRSS4表達A為TMPRSS4蛋白表達水平;B為TMPRSS4基因活性。a為P<0.05,與0 μmol/L PEITC處理組同細胞比較;b為P<0.05,與10 μmol/L PEITC處理組同細胞比較;c為P<0.05,與30 μmol/L PEITC處理組同細胞比較。

2.5 沉默TFPI-2對細胞增殖的影響

轉染組A549、H1299細胞增殖率及TMPRSS4 mRNA均顯著高于空白組和siRNA組(圖5)。

圖5 沉默TFPI-2對A549和H1299細胞增殖和TMPRSS4 mRNA水平的影響A為細胞增殖;B為TMPRSS4 mRNA表達水平。1為空白組;2為siRNA組;3為轉染組。a為P<0.05,與空白組同細胞比較;b為P<0.05,與siRNA組同細胞比較。

2.6 過表達TMPRSS4對細胞凋亡的影響

轉染pcDNA3.0-TMPRSS4過表達質粒,顯示質粒序列與目的序列相同,符合實驗要求(圖6A、B)。轉染pcDNA3.0-TMPRSS4質粒后,A549、H1299細胞凋亡率顯著低于空白組、空載體組(圖6C)。

圖6 過表達TMPRSS4對A549和H1299細胞凋亡的影響A為pcDNA3.0-TMPRSS4過表達質粒測序結果;B為A549和H1299細胞過表達TMPRSS4鑒定結果;C為細胞凋亡。

3 討 論

PEITC作為人工合成的異硫氰酸化合物,是一種潛在的抗腫瘤藥物[7]。盡管尚未應用于臨床,但大量研究證實,PEITC能夠有效抑制多種腫瘤細胞的增殖、黏附、遷移及侵襲[8-9]。盡管本課題組前期已經證實了PEITC對肺癌細胞增殖的抑制作用,但其抗肺癌的分子機制尚未完全明確。本研究結果顯示,PEITC能夠通過抑制TFPI-2甲基化下調TMPRSS4表達進而抑制A549和H1299細胞增殖。

腫瘤細胞的增殖分化通常受多種基因的調控,而TFPI-2是目前已知的一種重要的抑癌基因,其具有抑制腫瘤發展、促進細胞凋亡等多種生物學功能[10-11]。研究表明,在肺癌細胞中通過轉染方法上調TFPI-2水平后可顯著降低細胞的增殖能力,表明TFPI-2是肺癌細胞發生發展過程中的關鍵因子,也是一個潛在的治療靶點[12]。本研究采用PEITC處理肺癌細胞后,細胞內TFPI-2表達顯著增加,而采用siRNA沉默TFPI-2表達后,PEITC對A549、H1299細胞增殖的抑制作用出現了明顯的減弱,提示TFPI-2參與了PEITC對肺癌細胞的調控作用。TFPI-2啟動子甲基化是影響TFPI-2體內表達水平的重要因素。而在NSCLC患者體內TFPI-2的甲基化水平較高,并且與腫瘤的預后呈負相關[13]。本研究結果顯示,經PEITC處理后,肺癌細胞內TFPI-2的甲基化酶活性以及甲基化狀態的TFPI-2均顯著降低。因此,PEITC誘導肺癌細胞凋亡可能與細胞內TFPI-2表達增加,TFPI-2啟動子甲基化水平降低有關。

TMPRSS4能夠參與細胞黏附、增殖、侵襲等多種細胞生物學功能[14-15]。TMPRSS4在多種腫瘤細胞中異常表達。研究表明,TMPRSS4在NSCLC癌組織中的表達水平要顯著高于癌旁組織,而下調TMPRSS4的表達則可顯著抑制癌細胞的增殖與遷移[7,16]。本研究采用實時定量PCR證實,PEITC能下調A549、H1299細胞中TMPRSS4的表達,從而誘導細胞凋亡。轉染pcDNA3.0-TMPRSS4質粒后,細胞凋亡率檢測結果驗證之前的結論。

綜上,PEITC能抑制TFPI-2甲基化,從而下調TMPRSS4表達,影響A549及H1299細胞的增殖活性并誘導其凋亡;提示TFPI-2、TMPRSS4可能是肺癌治療的新靶點。