PUS7通過調(diào)節(jié)GSPT1的Ψ修飾促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞增殖

何曉榮, 吉華亮, 田堯, 馬林, 葛桂萍

1.海安市人民醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇海安 226600; 2.南通市中醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇南通 226007

肝癌是一種常見的致死性消化系統(tǒng)惡性腫瘤,是世界上癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1-2]。通常情況下,肝癌一旦確診,往往已是晚期,只有約20%的肝癌患者適合手術(shù)治療[3],發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有利于肝癌的治療。本研究根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫LIHC數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)肝癌患者假尿苷合酶(pseudouridine synthase,PUS)7的表達(dá)水平影響預(yù)后。PUS包含以下6個家族中的一類蛋白質(zhì):TruA、TruB、TruD、RsuA、RluA和PUS10p。這些蛋白主要對RNA進(jìn)行假尿苷(pseudouridine,Ψ)修飾發(fā)揮功能[4]。這些蛋白酶與人類疾病和腫瘤發(fā)生有關(guān)。例如,PUS1介導(dǎo)的假尿苷化參與乳腺癌細(xì)胞中的NR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]、PUS7可以影響結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[6]。然而,關(guān)于PUS7在肝癌中的具體作用尚未報道。基于此,本研究旨在探討PUS7對肝癌HepG2細(xì)胞的作用和其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌細(xì)胞HepG2購自上海澤葉生物科技有限公司。GSPT1抗體購自Affinity公司。GAPDH抗體購自北京Wellbio公司。PUS7抗體購自云南洛宇生物科技有限公司。Ψ抗體購自Diagenode公司。本研究所有的siRNA、過表達(dá)質(zhì)粒均由北京擎科設(shè)計(jì)合成。PUS7敲除的HepG2細(xì)胞由南京金斯瑞公司提供。siNC的序列:正義鏈為5′-UGAAGUUCACCUUGAUGCCGU-3′,反義鏈為5′-GGCAUCAAGGUGAACUUCAAG-3′。siPUS7的序列:正義鏈為5′-UUUUUUGUCUCUUCAACUGGG-3′;反義鏈為5′-CAGUUGAAGAGACAAAAAAAC-3′。siGSPT1的序列:正義鏈為5′-AUUCUUCUGGAGACAUUUCUG-3′,反義鏈為5′-GAAAUGUCUCCAGAAGAAUCA-3′。PUS7 CRISPR Guide RNA目標(biāo)序列:5′-TTAATATTGAAACCCCGCTC-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人肝癌細(xì)胞HepG2接種到含10%FBS、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,并在5% CO2和37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為siNC組(轉(zhuǎn)染siNC)、siPUS7組(轉(zhuǎn)染siPUS7)、siGSPT組(轉(zhuǎn)染siGSPT1)、Vector組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)空載體)、PUS7組(轉(zhuǎn)染PUS7過表達(dá)質(zhì)粒)、GSPT1組(轉(zhuǎn)染GSPT1過表達(dá)質(zhì)粒)。將siRNA或質(zhì)粒和Lipofectamine 2000在室溫下通過Opti-MEM稀釋5 min,混合后在室溫下孵育30 min,將該混合物加入到細(xì)胞中并孵育6 h,將培養(yǎng)基換回含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72 h進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法測定細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞以每孔1×103個細(xì)胞接種在96孔板中。然后,在指示的時間點(diǎn)中向每個孔中加入CCK-8溶液(10 mL,在100 mmol/L DMEM中),培養(yǎng)細(xì)胞4 h。使用Rayto-6000系統(tǒng)在450 nm波長處測量光密度值。

1.4 PUS7和GSPT1在肝癌患者中的生存曲線

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)中LIHC數(shù)據(jù)集,在HPA數(shù)據(jù)庫中分析不同PUS7和GSPT1表達(dá)水平在肝癌患者的生存曲線。

1.5 半定量蛋白質(zhì)質(zhì)譜

敲低或過表達(dá)PUS7后,將肝癌細(xì)胞HepG2的總蛋白采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對細(xì)胞進(jìn)行半定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析。將靶向的凝膠帶切成小塊并進(jìn)行凝膠胰蛋白酶消化。凝膠用50%CH3CN、30%CH3CN/100 mmol/L NH4HCO3、50%CH3CN/50 mmol/L NH4HCO3和50%CH3CN/25 mmol/L NH4HCO3固定,直到凝膠開始澄清。干燥后,將凝膠用MS級修飾的胰蛋白酶在4 ℃下消化1 h。然后,添加足夠的25 mmol/L NH4HCO3以覆蓋凝膠片,并在37 ℃下繼續(xù)消化16 h。添加50 μL雙縮的H2O并孵育10 min。凝膠片中用60%CH3CN/5%TFA提取肽,并干燥至10 μL。然后在Q-TOF質(zhì)譜儀上鑒定制備的肽,并使用搜索軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的評估和免疫印跡

為了評估蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,加入蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX(30 mg/L),在處理后0、6、12 h收獲全細(xì)胞裂解物。通過免疫印跡分析測定GSPT1蛋白表達(dá)。富含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液用于制備全細(xì)胞裂解物。使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白水平。使用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分級分離,然后將蛋白質(zhì)印跡到硝酸纖維素膜上。隨后,在TBST[0.05%Tween 20、120 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)和150 mmol/L NaCl]中加入5%脫脂奶粉,25 ℃下阻斷非特異性結(jié)合1 h。將膜與指定的一抗在4 ℃下孵育過夜。之后,用TBST沖洗膜3次,并用HRP標(biāo)記的二抗接種。使用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)使蛋白質(zhì)條帶可視化。

1.7 RNA抽取與實(shí)時熒光定量PCR

使用RNA提取試劑盒分離總RNA,然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒通過反轉(zhuǎn)錄從總RNA合成cDNA。此后,使用SYBR Green PCR Kit在Bio-Rad CFX96系統(tǒng)上使用以下程序進(jìn)行RT-PCR:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,引物退火60 ℃ 1 min,最終延伸72 ℃ 30 s。對生成的熔解曲線進(jìn)行評估,并使用Applied Biosystems-SDS 1.9.1軟件確定指數(shù)擴(kuò)增階段的Ct值。

1.8 Ψ免疫沉淀

在PUS7敲除或沒敲除的HepG2細(xì)胞中,通過質(zhì)粒過表達(dá)并分為3組:Vector組(轉(zhuǎn)染空載體)、PUS7-WT組(轉(zhuǎn)染PUS7野生型質(zhì)粒)、PUS7-MT組(轉(zhuǎn)染PUS7TRUD結(jié)構(gòu)域缺失突變型質(zhì)粒)使用5 μg抗Ψ單克隆抗體或等量的小鼠IgG(用作陰性對照)。對HepG2細(xì)胞中分離的40 μg總RNA進(jìn)行RNA免疫沉淀。隨后通過實(shí)時熒光定量PCR分析免疫沉淀的RNA。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件(V.19.0)和Prism 9.0版進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在定量數(shù)據(jù)的組間比較中,應(yīng)用雙尾t檢驗(yàn)。Kaplan-Meier生存分析以及對數(shù)秩檢驗(yàn)用于生存曲線分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PUS7促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖

低表達(dá)PUS7的肝癌患者較高表達(dá)者具有較好的預(yù)后(P<0.05;圖1A)。敲低PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力下降(P<0.05);過表達(dá)PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力上升(P<0.05;圖1B和圖1C)。

圖1 PUS7促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖A為Kaplan-Meier生存分析以及對數(shù)秩檢驗(yàn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中不同PUS7表達(dá)水平肝癌患者的生存曲線;B為敲低PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力;C為過表達(dá)PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力。a為P<0.05,與siNC組和Vector組比較。

2.2 PUS7靶向GSPT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖

為了探討PUS7促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的下游分子,敲低或過表達(dá)PUS7后將肝癌細(xì)胞HepG2的總蛋白進(jìn)行半定量蛋白質(zhì)質(zhì)譜,發(fā)現(xiàn)多種蛋白的表達(dá)水平受到調(diào)控(圖2A)。使用siRNA敲低上述受到調(diào)控蛋白的相應(yīng)基因,發(fā)現(xiàn)敲低GSPT1后,肝癌細(xì)胞HepG2增殖能力下降(P<0.05;圖2B);敲低PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1的蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05;圖2C);過表達(dá)PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1的蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05;圖2D),PUS7過表達(dá)后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖水平較Vector組上升(P<0.05);過表達(dá)GSPT1后,肝癌細(xì)胞HepG2增殖能力上升(P<0.05圖2E和圖2F)。過表達(dá)PUS7的同時敲低GSPT1后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖水平無顯著變化(圖2G)。低表達(dá)GSPT1的肝癌患者具有較好的預(yù)后(χ2=8.47,P<0.05;圖2H)。

圖2 PUS7調(diào)節(jié)GSPT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2增殖A為敲低或過表達(dá)PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行總蛋白半定量蛋白質(zhì)質(zhì)譜的蛋白表達(dá)水平;B為siRNA敲低受到PUS7調(diào)控基因后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力;C為敲低PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2中PUS7和GSPT1的蛋白表達(dá)水平;D為過表達(dá)PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2中PUS7和GSPT1的蛋白表達(dá)水平;E為敲低GSPT1后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力;F為過表達(dá)GSPT1后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力;G為過表達(dá)GSPT1或/和敲低GSPT1后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力;H為Kaplan-Meier生存分析以及對數(shù)秩檢驗(yàn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中不同GSPT1表達(dá)水平肝癌患者的生存曲線。a為P<0.05,與siNC組和Vector組比較。

2.3 PUS7對GSPT1進(jìn)行Ψ修飾影響GSPT1翻譯

實(shí)時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)敲低或者過表達(dá)PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1的mRNA水平均無顯著變化(圖3A和圖3B)。CHX處理后肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1的蛋白水平與DMSO組比較無顯著變化(圖3C)。敲低PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 Ψ修飾下降(P<0.05);過表達(dá)PUS7后肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 Ψ修飾上升(P<0.05;圖3D和圖3E)。PUS7敲除后肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 Ψ修飾下降(P<0.05)。在PUS7敲除細(xì)胞系中,過表達(dá)野生型PUS7后GSPT1 Ψ修飾上升(P<0.05);過表達(dá)突變型PUS7(酶活TRUD結(jié)構(gòu)域缺失型)后GSPT1 Ψ修飾無顯著改變(圖3F)。

圖3 PUS7對GSPT1進(jìn)行Ψ修飾影響GSPT1翻譯A為敲低PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 mRNA水平;B為過表達(dá)PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 mRNA水平;C為蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理0、6、12 h后肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1的蛋白水平;D為敲低PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 Ψ修飾水平;E為過表達(dá)PUS7后,肝癌細(xì)胞HepG2中GSPT1 Ψ修飾水平;F為在PUS7敲除細(xì)胞系中,過表達(dá)野生型PUS7或突變型PUS7(酶活TRUD結(jié)構(gòu)域缺失型)后GSPT1 Ψ修飾水平。a為P<0.05,與siNC組或Vector組比較。

3 討 論

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率呈上升趨勢,尤其是在中國[7]。盡管最近在肝癌治療方面取得了進(jìn)展,包括手術(shù)切除、射頻消融、肝移植和經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞,但大多數(shù)肝癌患者的預(yù)后仍然很差[8]。因此,闡明肝癌進(jìn)展的效應(yīng)分子和信號通路對于開發(fā)新的治療策略和更有效的治療至關(guān)重要。本研究通過半定量蛋白質(zhì)質(zhì)譜和遺傳學(xué)操作鑒定了影響肝癌細(xì)胞增殖能力的關(guān)鍵分子PUS7和GSPT1,靶向PUS7/GSPT1軸可能是治療肝癌的一種新方法。

以前的研究已經(jīng)證明了PUS7介導(dǎo)的假尿苷化在翻譯和腫瘤發(fā)生中的作用[6]。然而,PUS7在肝癌發(fā)展中的作用仍然知之甚少。在這項(xiàng)研究中,發(fā)現(xiàn)PUS7通過依賴mRNA假尿苷化的方式調(diào)節(jié)GSPT1來增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖。之前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[9],PUS7的敲低不會影響細(xì)胞增殖,但會導(dǎo)致hESCs中細(xì)胞大小的增加。PUS10還影響多種人細(xì)胞系的細(xì)胞增殖[10]。這些結(jié)果不僅強(qiáng)調(diào)了PUS在細(xì)胞過程中的重要性,而且還提供了PUS生物學(xué)功能中的組織特異性。由于關(guān)于單個假尿苷酸化酶功能的信息很少,因此需要未來的研究來確定PUS在不同細(xì)胞表型背景下的作用。

GSPT1被定義為一個真核肽鏈釋放因子,是肝癌和其他實(shí)體瘤的增殖相關(guān)蛋白[11]。值得注意的是,以前的研究只確定了對GSPT1的調(diào)控有貢獻(xiàn)的miRNAs名單[12-15]。在此,本研究證明了GSPT1作為PUS7的下游靶點(diǎn),在功能上負(fù)責(zé)PUS7介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖,提供了一個新的調(diào)節(jié)層。然而,PUS7的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是多樣化和復(fù)雜的。例如,本研究的蛋白質(zhì)組分析數(shù)據(jù)說明,PUS7可以改變多種蛋白的表達(dá)水平。雖然受到PUS7調(diào)控的蛋白并不影響肝癌細(xì)胞的增殖,但是是否在肝癌發(fā)生發(fā)展的其他方面發(fā)揮作用仍有待于驗(yàn)證。此外,PUS7是直接調(diào)節(jié)GSPT1 Ψ修飾來影響GSPT1的蛋白表達(dá),其他蛋白是否也是基于這一機(jī)制而受到調(diào)控也有待于驗(yàn)證。因此,本研究不能排除其他基因參與PUS7介導(dǎo)的生物功能。

綜上所述,PUS7通過調(diào)節(jié)GSPT1 Ψ修飾促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。因此,靶向PUS7/GSPT1軸可能是治療肝癌的一種新方法。