沉默lncRNA-UCA1對乏氧誘導NSCLC細胞A549放射抵抗的作用機制

宗斌, 房棟, 張文琪, 劉意

鎮江市中西醫結合醫院科教部,江蘇鎮江 212004

肺癌是臨床上常見的呼吸系統惡性腫瘤,其發病率、病死率和復發率都較高[1]。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。臨床上,放射治療是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的一種重要輔助治療手段,但由于NSCLC的異質性,產生了一定的放射抵抗,使放療效果不容樂觀[2]。研究表明,乏氧微環境是影響腫瘤產生放射抵抗的重要因素,激活缺氧誘導因子,影響腫瘤細胞損傷后的修復與耐受能力[3]。長鏈非編碼RNA(long chain noncoding RNA,lncRNA)是一組長度大于200 bp的非編碼蛋白質RNA[4]。尿路上皮癌相關基因1(urothelial carcinoma associated gen 1,UCA1)是在多種腫瘤中普遍表達的長鏈非編碼RNA,參與腫瘤的發生發展[5]。UCA1在腫瘤治療中耐藥和放射抵抗方面發揮著關鍵作用,但lncRNA-UCA1對乏氧誘導NSCLC放射抵抗的作用及機制仍有待探索。本研究通過乏氧誘導裸鼠模型,siRNA調控UCA1的表達,探討lncRNA-UCA1對乏氧誘導NSCLC放射抵抗的影響及潛在的機制。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

非小細胞肺癌細胞株A549、H1650、H460和人正常支氣管上皮細胞株HBE購自北京國家實驗細胞資源共享服務平臺。雄性BALB/C無胸腺裸鼠(SPF級,4～6周齡)購自北京維通利華公司。

DMEM細胞培養基、FBS和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco生物公司;青霉素、鏈霉素購自美國MCE生物公司;細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術公司;TRIzol試劑購自北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒、Lipo2000購自美國Invitrogen公司;B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X,BAX)、磷酸化蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(phosphorylated protein serine threonine kinase,p-Akt)及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylase mammalian target of rapamycin,p-mTOR)購自美國CST公司;lncRNA-UCA1 si-RNA購自上海吉凱基因化學技術有限公司。細胞恒溫CO2培養箱購自德國Binder公司;細胞超凈工作臺購自廣州祿米實驗室設備科技有限公司;Novoexpress流式細胞儀購自美國艾森生物公司;Eclipse Ti-s倒置顯微鏡購自日本Nikon公司;凝膠成像系統、實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-red公司。

1.2 細胞培養

10%FBS和1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養基培養細胞,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中,隔天換細胞培養液。

1.3 細胞分組及處理

取對數生長期細胞接種于六孔板中,接種密度為1×105個/孔,設置3個復孔;置于常氧培養箱中繼續培養,當細胞生長融合至60%～70%時進行實驗。依據是否轉染lncRNA-UCA1干擾序列,將細胞分為si-NC組(未轉染)及si-RNA組(轉染lncRNA-UCA1干擾序列)。lncRNA-UCA1干擾序列:正義鏈為5′-GCCATATGAAGACACCCTA-3′,反義鏈為5′-TTAATCCAGGAGACAAAGA-3′。細胞轉染結束后進行乏氧培養,將在正常培養條件下生長穩定后的細胞轉移至含1%O2、5%CO2、94%N2的培養箱中繼續培養24 h[6-7],將乏氧培養后細胞置于線性加速器之下(劑量率為2 Gy/min),予以4 Gy的X射線照射,放射源距為100 cm[8]。

1.4 平板克隆形成實驗

取處理后細胞置于常氧培養環境中2周,觀察至肉眼可見細胞克隆形成,終止培養。4%多聚甲醛固定,0.25%結晶紫染色,流水清洗,置于烘箱中干燥。根據克隆個數,計算出各組平均致死量(D0)、準域劑量(Dq)、外推數(N)、放射增敏比(sensitive enhancement ratio,SER)。

1.5 qRT-PCR檢測lncRNA-UCA1 mRNA表達水平

采用TRIzol試劑提取細胞總RNA,使用Takara反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA,使用Takara試劑盒SYBR Prime Ex Taq進行序列擴增。以β-actin為內參,β-actin上游引物為5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′,下游引物為5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′,采用2-ΔΔCT法計算UCA1的表達水平。lncRNA-UCA1序列:上游引物為5′-ACGCTAACTGGCACCTTGTT-3′ ,下游引物為5′-TGGGGATTACTGGGGTAGGG-3′, β-actin序列:上游引物為5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′,下游引物為5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡率

取處理后細胞種于六孔板中(1×105個/孔),設置3個復孔,使用0.25%胰酶消化中和收集細胞,5 000 r/min離心5 min,棄掉上清,加入PBS緩沖液洗滌細胞,5 000 r/min離心5 min,棄掉上清,加入預冷的70%乙醇,在旋渦振蕩器上輕柔混勻,置于4 ℃環境中固定24 h;1 000 r/min離心5 min,PBS緩沖液重懸洗滌細胞,5 000 r/min離心5 min,使用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率。

1.7 Western blotting檢測BAX、Bcl-2、p-Akt、p-mTOR及β-actin蛋白含量

將RIPA蛋白裂解液加入細胞中,冰上放置充分裂解15 min;收集細胞后超聲破碎,4 ℃、12 000 r/min低溫高速離心20 min,提取蛋白液;采用BCA法定量蛋白含量。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳2 h,轉印至PVDF膜1.5～2.0 h,封閉液封閉2 h,加入1∶1 000一抗,4 ℃環境下孵育過夜;TBST緩沖液清洗,二抗孵育2 h,TBST緩沖液清洗,使用Rio-red凝膠成像系統曝光顯影。

1.8 裸鼠成瘤實驗

取對數生長期si-NC及si-RNA轉染的A549細胞100 μL(1×107個/mL),分別接種于裸鼠(5只/組)右側腋窩皮下,根據接種細胞的不同分為si-NC組及si-RNA組。各組接種后,隔天稱量裸鼠體質量并記錄。第7天時,裸鼠皮下接種處觀察到肉眼可見的結節;第15天時,裸鼠皮下接種處觀察到皮膚表面有明顯不規則腫塊,予以4 Gy X-射線照射成瘤位置,繼續正常飼養1周;第20天頸椎處死法處死裸鼠,完整剝離瘤體,游標卡尺測量瘤體最大直徑,稱量、拍照、記錄。

1.9 統計學分析

使用GraphPad Prism 8.0版本統計軟件進行實驗數據統計,計數資料采用χ2檢驗,計量資料采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同NSCLC細胞對放射的敏感性

平板克隆實驗結果顯示,HBE細胞D0、Dq、N、SER值顯著低于A549、H1650、H460細胞(P<0.05;表1),提示NSCLC細胞A549、H1650、H460存在放射抵抗,由于A549細胞在放射生物參數中差異最明顯,故選用A549作為后續實驗細胞。

表1 不同NSCLC細胞對放射的敏感性

2.2 不同NSCLC細胞中常氧和乏氧狀態下lncRNA-UCA1的表達水平比較

在常氧(常氧組)和乏氧(乏氧組)環境中分別處理細胞后,qRT-PCR檢測結果顯示,細胞A549、H1650、H460在乏氧狀態下lncRNA-UCA1的表達水平顯著高于常氧狀態下(P<0.05;表2);提示乏氧促進lncRNA-UCA1的表達,故后續考察乏氧狀態下沉默lncRNA-UCA1對A549細胞的影響。

表2 不同NSCLC細胞中常氧和乏氧狀態下lncRNA-UCA1的表達水平比較

2.3 沉默lncRNA-UCA1對A549細胞放射敏感性、細胞周期及凋亡率的影響

平板克隆實驗及細胞周期結果顯示,與si-NC組比較,si-RNA組D0、Dq、N值顯著降低,G2期細胞比例下降(P<0.05),細胞凋亡率顯著增加(P<0.05;表3)。

表3 A549細胞放射敏感性、細胞周期及凋亡率變化

2.4 沉默lncRNA-UCA1對A549細胞Bcl-2、BAX、p-Akt及p-mTOR蛋白含量的影響

Western blotting蛋白印跡結果顯示,與si-NC組比較,si-RNA組p-mTOR、p-Akt、Bcl-2表達水平顯著下調,BAX表達水平顯著上調(P<0.05;圖1)。

圖1 Bcl-2、BAX、p-Akt及蛋白相對含量1為β-actin;2為p-Akt;3為p-mTOR;4為Bcl-2;5為BAX。a為P<0.05,與si-NC組比較。

2.5 裸鼠成瘤能力

結果顯示,與si-NC組比較,si-RNA組腫瘤增殖變慢,腫瘤的體積明顯縮小(P<0.05;圖2)。

圖2 lncRNA-UCA1對裸鼠成瘤能力的影響A為瘤體體積;B為lncRNA-UCA1對裸鼠成瘤瘤體形態;C為20天時瘤體質量。a為P<0.05,與si-NC組比較。

3 討 論

NSCLC對化療藥物不敏感,故放射治療是其主要的治療方法[9-10]。由于腫瘤異質性和其乏氧微環境下產生放射抵抗,對治療效果產生不良影響,引起預后不良和高復發率,因此,積極探索腫瘤的放射抵抗對臨床腫瘤治療具有重要意義。

研究表明,lncRNA-UCA1在腫瘤中呈異常表達,其參與腫瘤的發生發展,影響腫瘤的放射敏感性[11]。Fotouhi等[12]研究表明,UCA1的缺失會誘導輻射敏感性、降低增殖能力并破壞細胞周期進程,這可能是通過改變Akt信號和誘導細胞周期在G2/M過渡時停止而發生的。研究發現,lncRNA-UCA1通過激活PI3K/Akt途徑降低人宮頸癌細胞放射增敏性;經X射線照射前后,lncRNA-UCA1在大腸癌放射抵抗細胞CCL244中差異性表達,影響細胞的放射敏感性[13]。本研究結果表明,lncRNA-UCA1通過激活Akt/mTOR信號通路調控A549細胞的放射抵抗。

細胞周期的調控極其復雜。腫瘤在放射化療后引起腫瘤細胞DNA損傷,從而影響細胞周期和修復機制的啟動[14]。沉默lncRNA-UCA1可以逆轉放射誘導的周期阻滯,增加A549細胞的放射敏感性。細胞凋亡是高度保守的程序性死亡,在組織和細胞的發育過程中維持多細胞生物內環境的穩態[15]。外源性死亡受體依賴途徑和內源性線粒體依賴途徑是最具有特征的凋亡通路,Bcl-2家族蛋白是公認的凋亡調控因子,Bcl-2和BAX是主要的效應因子,與細胞的凋亡進程密切相關[16]。沉默lncRNA-UCA1后,細胞凋亡率顯著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調,促凋亡蛋白BAX表達顯著上調,從而促進放射誘導細胞凋亡,增加A549細胞的放射敏感性。

Akt/mTOR信號通路是腫瘤發生的內在因素,Akt蛋白對正常細胞和癌細胞的增殖生長至關重要,其下游蛋白mTOR在細胞過程中也發揮著不可或缺的作用[17]。研究表明,Akt/mTOR通路廣泛參與腫瘤的發生發展和放射抵抗[18]。Bamodu等[19]研究發現,PDK1表達上調激活PI3K/Akt/mTOR信號通路促進肝癌的輻射抵抗和去分化表型,為放射抵抗的肝癌患者提供了潛在的治療方法。Tan等[20]研究表明,依魯替尼聯合放射誘導G2/M阻滯和細胞凋亡,靶向激活EGFR/Akt/mTOR信號通路從而提高胰腺癌細胞對放射治療的敏感性。沉默lncRNA-UCA1能下調細胞體內和體外的p-Akt和p-mTOR蛋白表達。

綜上所述,沉默lncRNA-UCA1通過激活Akt/mTOR通路抑制NSCLC A549細胞的放射抵抗,增加其放射治療敏感性。