載脂蛋白E在膽固醇逆向轉運中作用的研究進展

劉欣, 龍雄權, 陳金智,3, 胡密, 唐宛瑩, 何平平, 歐陽新平

1.湖南師范大學醫學院生理學教研室 湖南省生殖與轉化醫學研究中心,湖南長沙 410081;2.南華大學衡陽醫學院基礎醫學院生理學教研室 神經科學研究所 神經變性與認知障礙衡陽市重點實驗室,湖南衡陽 421001;3.長沙泰和醫院,湖南長沙 410004

載脂蛋白E(apoprotein E,ApoE)在人體細胞中廣泛表達,參與膽固醇的流出及膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport,RCT),維持人體內膽固醇穩態。近年研究已經證實,ApoE可以通過促進RCT等多種途徑,減少動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)等疾病的發生[1-2]。ApoE模擬肽類藥物的開發已成為科學研究的熱點,最近研究表明,ApoE模擬肽介導循環性As脂蛋白的清除,促進RCT,顯著降低血漿膽固醇水平,從而減少As發生。ApoE模擬肽還具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用。雖然近年來在ApoE及其模擬肽與RCT的研究取得一些進展,但仍存在許多問題尚未闡明。本文對ApoE在RCT中的作用進行綜述,期望為As等心血管疾病的治療尋找新的靶點和方法。

1 ApoE的分布

ApoE在人體細胞中廣泛表達,包括肝細胞、肝竇細胞、脾巨噬細胞、淋巴結、肺組織、腎上腺各層的膠質細胞、腎小球囊細胞和睪丸平滑肌細胞等。其中,肝細胞是ApoE合成的主要部位,在大腦(數量僅次于肝臟)、腎上腺、睪丸、皮膚、腎臟、脾臟和脂肪組織以及各種組織的巨噬細胞中也很容易檢測到ApoE的產生[3]。ApoE在少數細胞中不表達,例如腸道上皮細胞[4]。

2 ApoE結構、分類、調控與功能

2.1 ApoE的結構

ApoE含有299個氨基酸殘基,有一個包含四螺旋結構22 kDa(1～199個殘基)的N端結構域和一個包含一系列兩性分子α螺旋10 kDa(215～299個殘基)的C端結構域,N端結構域和C端結構域通過蛋白酶敏感環連接,317個氨基酸的蛋白質失去18個氨基酸的信號肽,成為含有N-末端、鉸鏈和C-末端結構域的成熟蛋白質。后者包含與磷脂、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、硫酸肝素蛋白多糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)結合的區域,以及介導自結合的區域(圖1)。N端結構域容納低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)蛋白家族的結合位點與HSPG的結合區,C端結構域承載高親和力的脂質結合位點,而在沒有脂質的情況下,C端結構域介導蛋白質-蛋白質相互作用,從而促進ApoE同源二聚體和四聚體形成[5]。ApoE在N-末端螺旋束的螺旋上有許多賴氨酸和精氨酸(arginine,Arg)殘基,形成一個帶正電荷的口袋,與LDLR蛋白家族成員脂蛋白結合部位的酸性殘基相互作用[6]。在N端,4個螺旋聚集在一起,插入的鉸鏈結構域被C端以折疊回LDLR結合區的方式鎖定,只有當C末端在嵌入磷脂時移開時,這一區域才會暴露,這確保ApoE只是脂蛋白的活性配體。

圖1 ApoE的結構

2.2 ApoE的分類

人類ApoE主要有3種亞型,分別為ApoE2、ApoE3和ApoE4,其基因頻率分別為5%、77%和18%[7]。在這些亞型中,涉及單核苷酸多態性的某些位置彼此不同,導致ApoE基因的結構和功能發生巨大的變化[8]。ApoE2可以降低人體血漿中LDL水平,促進膽固醇的流出,對心血管系統和神經系統有一定的保護作用,但可能會引起高脂血癥[9]。ApoE3是34 kDa的可交換蛋白,作為最普遍的亞型,其在血漿和膽固醇穩態中起關鍵作用[10]。與ApoE3相比,ApoE2與LDLR的結合能力較低,而ApoE4與LDL的結合能力較高,這主要是因為在ApoE4中Arg-61和Glu-255之間存在鹽橋結構,而在ApoE2與ApoE3中都不存在此結構[11]。最近對英國生物庫中382 188名歐洲血統參與者的研究表明,ApoE4純合子人群患嚴重新冠肺炎的風險很高(2.36%),與ApoE3純合子人群相比,這種風險高出兩倍[12]。造成這種差異是否與ApoE4的結構有關仍待研究。

2.3 ApoE的表達調控

ApoE的表達受多種因子的調控(圖2)。核轉錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、AP-2、cAMP、淀粉樣β蛋白(amyloid beta,Aβ)、睪丸孤兒受體-4(testicular orphan receptor 4,TR4)、特異性蛋白-1(specificity protein 1,Sp1)、肝X受體(liver X receptor,LXR)、ATP結合盒轉運體(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome-proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)等因子,這些因子能顯著提高ApoE的表達。除此之外,成纖維細胞生長因子-1(gibroblast growth factor-1,FGF-1)通過磷脂酰肌醇3-羥基激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase,PI3K/Akt)刺激ApoE的合成,并依賴維甲酸X受體α(retinoid X receptor α,RXRα)誘導ApoE的表達,ERK通路的激活也可上調ApoE的表達[13]。ApoE基因表達還受到其膽固醇含量的調控,在人類THP-1巨噬細胞細胞中,膽固醇負荷使其ApoE合成量上調約15倍,這一過程是通過上調ApoE基因的表達實現[14]。Reardon等[15]發現干擾素(interferon,IFN)-γ可以減少ApoE的分泌,引起腹腔巨噬細胞膽固醇的積累,促進As的形成。

圖2 ApoE的調控↑代表上調表達,⊥代表下調表達。很多因子能顯著上調ApoE的表達例如AP-1,AP-2,cAMP,Aβ,TR4,Sp1,RXR,ABCA-1,PPAR-γ,NK-κB,FGF-1。一些信號通路例如ERK通路也可上調ApoE的表達。值得注意的是,膽固醇負荷可上調ApoE的表達,而ApoE可以促進RCT降低胞內膽固醇。IFNγ下調ApoE的表達,減少ApoE分泌。

2.4 ApoE的功能

ApoE是LDLR的配體,也是肝細胞乳糜微粒(chylomicron,CM)殘粒受體的配體,與脂蛋白代謝密切相關,能夠參與膽固醇的流出及RCT,維持人體的膽固醇穩態,抑制As的發生。肝細胞分泌的ApoE大多數與極低密度脂蛋白(very slow density lipoprotein,VLDL)顆粒有關,介導清除脂解產生的腸源性脂蛋白殘留物[16]。冷暴露降低血清膽固醇同樣依賴ApoE的作用[17]。細胞內ApoE可能在生理或病理生理上調節多種細胞過程,包括細胞骨架的組裝和穩定、線粒體的完整性和功能以及樹突的形態和功能[3]。ApoE可以將巨噬細胞表型從促炎M1型轉變為抗炎M2型,抑制CD4+和CD8+淋巴細胞,減少白細胞介素(interleukin,IL)-2的產生,從而發揮抗炎作用。ApoE還具有抗氧化性,可以調節各種分子的水平[18]。

3 ApoE與膽固醇逆向轉運

3.1 膽固醇逆向轉運

RCT是指外周細胞的膽固醇通過血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)進入肝臟,再經糞便排出的過程。外周組織細胞RCT包括三個連續的步驟:①外周組織細胞游離膽固醇(free cholesterol,FC)流出到HDL和(或)載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-I,ApoA-I)上;②HDL內FC受血漿卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶(lecithin-cholesterolacyltransferase,LCAT)酯化形成膽固醇酯(cholesterol ester,CE)并轉移至HDL核心;③HDL內CE由肝細胞HDL受體家族成員(HDL recepter,HDLR)和(或)B族I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I,SR-BI)攝取并在肝中被代謝。RCT的第一步是膽固醇的流出,巨噬細胞內的膽固醇脂滴通過自噬體轉移到溶酶體,產生FC,FC轉移到質膜,然后流出。膽固醇的流出有4種途徑:簡單擴散;SR-BI介導的擴散;在細胞外受體存在時,由ABCA1或三磷酸腺苷結合匣轉運蛋白G1(ATP-binding cassette sub-family G member 1,ABCG1)介導的膽固醇流出。前兩者為被動過程,后兩者則為主動運輸過程。膽固醇的外流需要細胞外低脂受體的參與,主要是ApoA-Ⅰ,也有含較少FC的新生HDL[4]。流出的膽固醇與細胞外低脂受體相結合形成新生的高密度脂蛋白,并在LCAT的作用下酯化,酯化的膽固醇約20%進入HDL內核,80%轉移至VLDL和LDL,自此RCT的第二步已完成。RCT的最后一步有兩種途徑,含有外流膽固醇的HDL可與SR-BI或HDL受體家族成員相結合,介導膽固醇進入肝細胞。此外,高密度脂蛋白中的膽固醇可以通過膽固醇酯轉移蛋白(cholesterolestertransferprotein,CETP)的作用轉移到含載脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)的LDL/VLDL中,LDL通過LDLR結合介導膽固醇轉移到肝細胞。含有ApoE的HDL與LDL都可以與特異的ApoE受體結合從而被肝細胞攝取。HDL中的膽固醇約70%在CETP的作用下轉移至LDL,通過LDL受體途徑在肝被清除,20%通過HDL受體在肝被清除,10%由特異的ApoE受體介導在肝被清除。一旦進入肝細胞,膽固醇就可以FC的形式轉移到膽汁中或在轉化為膽汁酸后通過糞便從體內排出[4](圖3)。

圖3 ApoE與膽固醇逆向轉運

ApoE促進RCT,外源性和內源性ApoE都能促進膽固醇從膽固醇負荷的巨噬細胞外流。內源性ApoE通過與細胞表面LDLR、蛋白聚糖和膜脂質結合促進膽固醇外流。外源性ApoE與ABCA1相互作用形成新生的盤狀高密度脂蛋白,作為細胞外膽固醇低脂受體發揮作用。新生的盤狀高密度脂蛋白與排出的膽固醇一起進入血漿,通過一些步驟結合到成熟的球形高密度脂蛋白顆粒中。HDL通過與SR-B1或HDLR相互結合并將膽固醇輸送到肝細胞。此外,CETP可以識別LDL中的ApoE或ApoB,介導CE從HDL向LDL轉移,同時HDL表面的部分ApoE也轉移到LDL,新生的LDL與LDLR相互結合被肝細胞攝取。含有ApoE的HDL與LDL都可以與特異的ApoE受體結合從而被肝細胞攝取。

3.2 ApoE在RCT第一環節的作用

HDL通過巨噬細胞膜表面受體介導細胞膽固醇流出是防止血管內皮下膽固醇堆積最有效的方式[19],ApoE在這一過程中可能作為膽固醇受體發揮作用,表達ABCA1的HeLa細胞和J774細胞與人ApoE2、ApoE3和ApoE4 3種亞型蛋白共同孵育后刺激膽固醇的外流證明這一點。ApoE作為膽固醇受體的功能主要是由C-末端結構域實現的,N-末端四螺旋束區則是膽固醇流出相對較差的受體。在每個分子基礎上,C結構域刺激膽固醇外流的效率與完整的ApoE相同,ApoA-1 N端結構域和ApoE C端結構域組成的嵌合分子,比完整的載脂蛋白和相互嵌合體更具膽固醇受體活性,這也表明ApoE C端結構域有促進膽固醇流出的能力[20]。上述實驗皆是研究外源性ApoE對于膽固醇流出的作用,而內源性ApoE對于膽固醇流出的作用尚不可知。J774細胞一般不表達ApoE,然而在巨細胞病毒啟動子的控制下,可以表達人體的ApoE3。使用這種修飾過的J774細胞實驗,可以排除膽固醇介導ApoE基因表達上調的干擾,更好地觀察內源性ApoE和外源性ApoE分別對膽固醇流出和細胞膽固醇穩態的影響,從而找到它們潛在的差異。通過使用J774+E細胞,Mazzone等[21-22]研究發現,內源性ApoE在促進固醇流出方面比外源性ApoE更有效。內源性ApoE的分泌是通過與細胞表面LDLR,蛋白聚糖和膜脂質結合,與質膜形成一種特殊的聯系而完成的。減少內源性ApoE與這些細胞表面分子的聯系,可以減少膽固醇的流出。然而,外源性ApoE與細胞表面沒有觀察到這種聯系。在J774+E細胞中,研究人員還發現其膽固醇流出增加與ABCA1無關,這可能提示內源性ApoE介導膽固醇流出并不通過ABCA1途徑。不同亞型的ApoE與LDLR結合能力不同,內源性ApoE與LDLR結合能力與其促進膽固醇流出的能力呈負相關,在巨噬細胞內3種純合子亞型ApoE中,ApoE2促進膽固醇流出的能力比ApoE3和ApoE4強。由于外源性ApoE并不與LDLR相互作用,因此3種亞型外源性ApoE促進膽固醇流出的能力并無差異[4]。

3.3 ApoE在RCT第二、三環節的作用

ApoE除能促進膽固醇流出,也影響RCT的其他環節,在沒有CETP的情況下,ApoE能夠擴展HDL2的膽固醇負荷,從而運載更多的膽固醇至肝臟,分泌到膽汁中去[23]。將HDL2中的ApoE去除,這種擴展作用消失。Zanotti等[24]首次證明,ApoE在體內對巨噬細胞RCT有顯著的貢獻,并且這一作用完全歸因于ApoE在巨噬細胞中的表達。這一結論是通過分別向野生型小鼠和ApoE-/-小鼠注射膽固醇負載野生型小鼠腹腔巨噬細胞(高表達ApoE)與膽固醇負載ApoE-/-小鼠腹腔巨噬細胞得到的,注射膽固醇負載野生型小鼠腹腔巨噬細胞的小鼠膽固醇逆向效率顯著提高,動脈壁上巨噬細胞是否也符合這一結論目前仍不清楚。在ApoE與疾病之間的關系研究領域近年來研究并不深入,大規模人群研究表明,ApoE4等位基因攜帶者患As風險增加1.7倍[25]。ApoE血漿水平與不同的死亡原因有關:高ApoE水平與心血管疾病和癌癥死亡有關,而低ApoE水平與癡呆癥相關死亡有關。這可能是因為患有心血管疾病的患者需要更高的ApoE水平降低血漿膽固醇,減緩病程進展[26]。

總之,無論是內源性ApoE還是外源性ApoE,它們在RCT過程中都起著重要作用,這些作用不局限于RCT某一環節,缺乏ApoE將嚴重降低RCT效率從而引起As發生。

4 ApoE模擬肽

基于對ApoE促進RCT機制的研究,研發ApoE模擬肽類藥物成為治療As等疾病的一種新思路。ApoE模擬肽類藥物目前正在進行臨床前和臨床評估,取得非常好的試驗效果,具有廣闊的發展前景[27]。如上所述,ApoE刺激膽固醇流出的功能主要是由C結構域實現的,基于這一認識,研究人員將C結構域便作為開發ApoE模擬肽的基礎,每個模擬物包含26個氨基酸。ATI-5261是研發出來的第一種ApoE模擬肽,雖然這種肽在體內可以促進巨噬細胞膽固醇的流出及逆向轉運,減少ApoE-/-老鼠As的發生,但表現出肌肉毒性[28]。CS-6253作為新型ApoE來源的ABCA1激動肽,它與ATI-5261有著相似的作用,但它沒有肌肉毒性[29]。ApoE模擬肽通過與LDLR和(或)熱休克蛋白相互作用,介導肝臟從循環中清除致As的ApoB,也具有增強HDL介導巨噬細胞膽固醇外流、減輕炎癥和抑制As發展的能力,同時ApoE模擬肽誘導巨噬細胞膽固醇外流的效率與天然ApoE3和ApoA-I相似,甚至更高[27]。Ac-hE18A-NH2可以降低動物模型中的血漿膽固醇,并表現出抗炎特性,是目前治療血脂異常的理想藥物,正在進行I期臨床試驗[30]。研究發現,ApoE模擬肽COG1410不僅可以減少蛛網膜下腔出血后的血腦屏障的破壞,在早期腦損傷中提供神經保護[31],還能減輕缺血性腦卒中的血腦屏障損傷[32]。COG1410治療還明顯改善早期腦損傷后的前庭運動功能和葡萄糖攝取功能,并使損傷周圍和同側半球的血管內皮生長因子生成減少,從而發揮神經保護作用[33]。同時COG1410還對耐藥性鮑曼不動桿菌表現出較強的抑菌活性[34]。ApoE模擬肽除擁有抗As、抗炎與抗菌的作用外,還表現出抗腫瘤作用,許多臨床前研究表明,載脂蛋白模擬物在癌癥動物模型中具有治療作用[35]。ApoE模擬肽還可以參與免疫調節,改善哮喘的疾病進展[36]。ApoE模擬肽功能的多態性與ApoE本身功能多態性有著密不可分的關系。

總體而言,ApoE模擬肽的研究正在迅速發展。除天然ApoE所具有的功能外,ApoE模擬肽還能提高HDL的水平與功能,顯著降低血漿膽固醇水平,其抗炎與抗氧化的功能使其具有極佳的抗As的特性。大量的臨床前與臨床研究都支持ApoE模擬肽具有不錯的治療效果,可以預測ApoE模擬肽即將成為心血管疾病防治的重要候選藥物。

5 小結與展望

總的來說,ApoE可以促進膽固醇的流出及RCT,降低患As的風險。在特定環境(細胞培養與體內培養)和特定細胞類型中,ApoE也可以影響膽固醇外流和RCT。在這些情況下,巨噬細胞膽固醇負荷在調節ApoE轉錄中的作用還沒有完全闡明。大多數研究都使用了放射性標記的膽固醇,但并不能探索巨噬細胞中完整的膽固醇穩態。將不同組織來源的巨噬細胞在體內包埋在藻酸鹽膠囊中,可能成為探索這些問題的可行方法。ApoE模擬肽類藥物是治療As和AD等疾病的理想藥物,雖然ApoE模擬肽常表現出肌肉毒性,ApoE模擬肽在體內減少As等疾病發生的確切機制尚不明確,但新型ApoE模擬肽已經成功解決肌肉毒性問題并且具有天然ApoE不具備的作用。種種趨勢表明,ApoE模擬肽具有非常好的發展前景。